急性淋巴细胞白血病患儿红血球中6-巯基嘌呤及其代谢产....docVIP

急性淋巴细胞白血病患儿红血球中6－巯基嘌呤及其代谢产物的HPLC分析 项目完成人：牟德海 郑家概 闫世平 辜英杰 喻凌寒 项目完成单位：中国广州分析测试中心 广东省化学危害应急检测技术重点实验室 6－巯基嘌呤（6-mercaptopuring, 6－MP）和硝基咪唑硫嘌呤（azathiopurine, Aza）主要作为抗肿瘤药用于治疗急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL），或者作为免疫抑制剂用于治疗炎性肠病、风湿关节炎、系统性红斑狼疮和抑制器官移植病人的急性排斥。Aza是6－MP的1－甲基－4－硝基－5咪唑硫衍生物，在体内降解生产6－MP，Aza抗肿瘤和免疫抑制的药物活性主要是来自其降解产物6－MP的代谢产物。 图1. 6－巯基嘌呤的代谢[1] 6－MP在体内的代谢主要有三条途径：（1）在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的作用下转化为6－硫次黄嘌呤核苷一磷酸（6-thioinosine monophosphate，TIMP），TIMP随后在一系列酶促反应中转化为活性代谢物6－硫鸟嘌呤核苷（6－thioguanine nucleotides, 6－TGNs）发挥细胞毒作用；（2）在硫嘌呤甲基转移酶（thiopurine methyltransferase，TPMT）作用下转化为无药物活性的甲基硫嘌呤（6－methylmercaptopurine, 6－MMP）;（3）在黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）作用下转化为6－硫尿酸（6－thiouric acid, 6－TUA）[1]，见图1。 与6－MP转化为活性代谢产物性6－TGNs相竞争的有两条途径：在TPMT作用下转化为6－MMP和在XO作用下转化为6－TUA。XO活性在个体之间的差异不大，而TPMP活性在不同个体之间有很大的差异。因而病人对6－MP反应（即药物的疗效和毒性）的差异主要决定于其体内TPMT的活性。已经发现红细胞中6—TGNs的含量与TPMT的活性呈负相关关系。在标准用药剂量下，TPMT活性低的个体能积累高浓度的6－TGNs导致致死性的骨髓细胞毒性。相反TPMT活性高的个体对硫嘌呤类药物可能没有反应，因为它们很快就被转化为无活性的6－MMP。因而通过监测接受硫嘌呤类药物治疗的病人血红细胞内6－MMP和6－TGNs的水平，据此确定准确的用药剂量，对提高治疗效果、减小药物毒副作用是非常关键的。在本项目的资助下，我们与广州医学院第一附属医院合作，研究建立了急性淋巴细胞白血病患者红血球中6－MP及其代谢产物的高效液相色谱分析方法，为6－MP个性化治疗提供基础。 实验 仪器与试剂 6－巯基嘌呤（6－mercaptopurine, 6－MP）、6－硫鸟嘌呤（6－thioguanine, 6－TG）、6－硫黄嘌呤（6－thioxanthine, 6－TX）、6－甲基硫嘌呤（6－methyl mercaptopurine, 6－MMP）、戊醇、乙酸苯汞（phenyl mercury acetate, PMA）和二硫苏糖醇（DL－dithiothreitol, DTT）为Sigma公司产品；甲醇、甲苯为色谱纯，其他试剂均为分析纯。 高效液相色谱仪：岛津LC－6A，配LC－6A高压输液泵、柱温箱、SPD-6AV可变波长紫外－可见分光检测器、系统控制器、CR－3A积分仪和色谱工作站。 试剂配制 （1）PMA－戊醇－甲苯溶液的配制：取1.85 mL戊醇，加入1000 mL甲苯中，摇匀，再加入0.5 g PMA，轻轻搅动1 h使PMA溶解，置于暗处保存。此溶液含PMA 1.3 mmol/L，含戊醇170 mmol/L。 （2）3.75 mmol/L DTT水溶液配制：取289.2 mg DTT溶于500 mL水中。 （3）0.5 mol/L H2SO4。 （4）3.4 mol/L NaOH。 （5）0.1 mol/L HCl。 标准溶液配制 分别取16.8 mg 6－TG、16.6 mg 6－MMP、17.0 mg 6－TX和17.1 mg 6－MP溶于水中并定容于100 mL，此溶液为贮备液I，含每种硫嘌呤1.00 μmol/mL。取10 mL贮备液I，稀释至100 mL，为贮备液II，含每种硫嘌呤100 nmol/mL；用贮备液II稀释成1 nmol/mL、2 nmol/mL、5 nmol/mL、10 nmol/mL、15 nmol/mL和20 nmol/mL的系列标准溶液备用。 样品处理 （1）血红细胞制备：采集正在接受硫嘌呤治疗的病人全血样本，肝素锂抗凝，室温下1000×g离心10 min，弃去血