原核生物的基因表达以及操作.pptVIP

重组基因的原核生物表达体系与产物的分离纯化;目的基因 载体;重组基因表达的目的;重组基因表达体系;大肠杆菌表达体系优越性：;大肠杆菌中表达体系的不足：;4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过 转译后的加工修饰（正确折叠和组装）， 而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中 并不存在； 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基 因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。; 启动子 核糖体结合位点(SD序列) 终止子 选择标记基因 复制子 ;启动子;报告基因（reporter gene）：特指那些编码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。 追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也可用来同任何一种目的启动子连接，因此其表达活性可作为检测启动子功能的依据。;;大肠杆菌的Lac启动子 ;大肠杆菌的trp启动子 ;Tac启动子 ;λ噬菌体的左向启动子PL;;条件： 　　必须选择一个有lacI的宿主菌。;非融合蛋白：指所表达的外源蛋白的N端或C端不含任何其他氨基酸。 所表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。 ;非融合蛋白特点： 表达时要求高：SD序列与ATG的距离要 合适。即使改变2-3个碱基，表达效率也 会大受影响。 优点：能够较好地保持原来蛋白的活性。 缺点：在宿主细胞内容易被蛋白酶降 解，蛋白产量低；分离纯化费时费力， 成本较高。;　　2. 分泌型表达载体 　　　载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。 ;　　3.融合蛋白表达载体系统 　　　表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。 如：pGEX、pET系列 　　 优点：便于融合蛋白的分离和纯化。 　组成结构： 　　1）启动子：tac 　　2）操纵基因：lacP 　　3）调节基因：lacI 　　4）S-D序列 　 5）ori：pBR322 ori 6）融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）;融合??白表达系统的构建的三个原则： 首先，受体细菌结构基因应能高效表达，且其 表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化。 其次，外源基因应插在受体菌结构基因的下游 区域，并为融合蛋白提供终止密码子。另外，两个 结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接 决定了融合蛋白的裂解方法。 最后，当两个蛋白编码序列融合在一起时，外;生命科学学院;用融合载体组合表达融合蛋白质： 以Ecoli. lacZ为靶基因的组合最典型，含三个不同 载体，每个载体都有一个lacZ启动子和SD序列，且在 lacZ基因下游部位具有一EcoRⅠ识别序列 (GAATTC) 5’上游存在着不同数量的G-C碱基对。三种情况必有一 个保持着正确的读码结构，产生出真实的融合蛋白质。;;用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来;pGEX-2X的插入区;4.其他融合蛋白系统 　　　His-tag（组氨酸标签） 　　　在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。 　　　His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。;融合蛋白：是指蛋白质的N末端由原核DNA序列或其他DNA序列编码，C端由真核DNA的完整序列编码。这样的蛋白质有一段短的原核多肽或具有其他功能的多肽和真核蛋白质结合在一起，故称为融合蛋白。 ;外源基因在原核细胞中的表达; 目标蛋白在细胞质中表达的主要优点是： 表达质粒的构建比较简单； 能够达到很高的目标蛋白表达量，一般可以达到占细 胞总蛋白的20%～40%。 目标蛋白在大肠杆菌系统表达的形式有二种： 在细胞内表现为不溶性的包涵体颗粒 包涵体存在于大肠杆菌细胞质中 在细胞内表现为可溶性的蛋白质 可溶性的目标蛋白质除可存在于细胞质中外，还可借 助于身的功能序列和大肠杆菌蛋白质加工、运输体系，最 终分泌到周质空间，或外泌到培养液中。;包涵体蛋白 　本质：细胞内蛋白质的不断聚集 包括：1.折叠状态的蛋白质的聚集作用；