第六章 DNA的体外重组与相关转移.pptVIP

;外源DNA;;重组DNA分子的构建需要考虑三个因素（P155） （1）实验步骤要尽可能地简单易行； （2）连接形成的“接点”序列，应能被一定的核酸内切限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段； （3）外源基因必须在表达载体的启动子下，并置于正确的ORF中，以便目的基因的表达。;一、粘性末端的连接;优点：实验操作简单，易于回收外源DNA片段 缺点（P156） （1）不易定向克隆 （2） 难插入特定的基因 （3）大片段DNA的重组率低 （4）载体易发生自身串联 （5）目的片段自身各拷贝之间可能自连;ligase;碱性磷酸酶的脱磷酸作用阻止线性的质粒DNA分子再环化;回收;同尾酶的连接; 对于两个不能互补的粘性末端的连接，通常采用平头末端的连接方式，即先将其处理成平头末端，再连接，具有两种情况。 （1）5‘突出末端的补平：大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片段； （ 2）3’突出末端的切平：T4噬菌体DNA聚合酶或S1核酸酶。 平头末端连接的缺点：连接效率低、破坏原有的识别序列、双向插入及多拷贝插入。;1、直接连接;1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。;; 用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。; ; ;④缺点：;（2）DNA接头 (adapter)连接法;; 接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。;Blunt-ended DNA;接头;Blunt-ended DNA;三、PCR产物的连接;引物1;CCTAGGCGG;带酶切位点的PCR产物;2、与T载体直接连接;A;四、DNA体外连接应注意的事项;2、DNA插入的方向正确;3、插入基因的开放阅读框（ORF）正确;4、防止载体自身环化连接;2. 载体自身环化连接（能存活）; 受体细胞：能够摄取外源DNA并使其稳定维持、具有应用价值和理论研究价值的细胞。 根据细胞的种类可分为三类： * 原核生物受体细胞 * 植物受体细胞 * 动物受体细胞;1、原核生物受体细胞;主要的原核受体细胞： 大肠杆菌，枯草杆菌，蓝细菌等;2、植物受体细胞;3、动物受体细胞;一、重组体导入原核细胞; 在0 ℃的CaCl2 低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀， Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，增加细胞膜的通透性。 转化时加入DNA后， Ca2+ 能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶的羟基－磷酸钙复合物，黏附在胞膜的外表面；42 ℃热激处理，细胞膜的液晶结构发生扰动，出现间隙，即可使外源DNA进入细胞内。;5、制备过程;（二）重组DNA导入原核细胞的方法;10ng重组DNA;基本原理： 在一定强度脉冲电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生暂时性缝隙或微孔，质粒或DNA重组分子便可由此微孔进入细胞实现外源基因的转移。 特点： 转化效率高（高于109/?gDNA）。;利用扫描电镜拍摄的电穿孔照片;LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6;定义 转化率是衡量转化效率的重要指标，其定义为：每微克载体DNA在最佳转化条件下进入受体细胞的分子数。 例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中有108个分子能进入受体细胞。如果一微克pUC18共有3×1011个分子，也就是说，每3000个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞（108/3×1011）。; 转化率的用途;① 重组质粒 ;a、生长状态; 把重组的噬菌体?DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的?噬菌体颗粒。; 加入新鲜培养基，30℃培养2小时，直至培养液中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选;（1）扩增操作： 转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的37℃培养45min~1.5h，噬菌体转染后的30℃培养等，均属扩增操作。 （2）扩增操作的目的 增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序 扩增和表达载体分子上的标记基因，便于筛选 表达外源基因，便于筛选和鉴定; 主要是以动植物病毒、反转录病毒及植物农杆菌Ti质粒直接转染或转化受体细胞，把外源DNA引入。 优点：定向性好、效率高、重复性好 缺点：载体的侵染范围有限;（1）基本原理 将转移的DNA溶液与适量CaCl2的