DNA Barcoding在药用植物鉴定的应用.ppt

DNA Barcoding在药用植物 鉴定中的应用;DNA条形码技术(DNA barcoding)是利用标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段(DNA barcode)自身在物种种内的特异性和种间的多样性而创建的一种新的生物身份识别系统,它可以对物种进行快速的自动鉴定。 DNA Barcoding的概念由加拿大动物学家Paul Hebert首次提出。;Paul Hebert等对动物界包括脊椎动物和无脊椎动物共11门13 320个物种的线粒体细胞色素c氧化酶亚基1（Cytochrome coxdase I，CO I）基因序列比较分析，除腔肠动物Cnidaria外，98%的物种遗传距离差异在种内0%-2%，种间平均可达到11.3%，据此提出可以用单一的小片段基因来代表物种；他们将超市用以区分成千上万种不同商品的条形码概念引入，把这种小片段基因序列称作物种的DNA条形码（DNA barcodes）并提出为全球生物编码的计划。 ;DNA条形码的原理;DNA条形码的标准;DNA条形码的优点;DNA条形码的优点; 操作及分析方法;植物DNA的提取;6.加等体积氯仿，混匀，12000r/min×5min，取上清； 7.加入0.6-1倍体积的异丙醇（沉淀DNA），混匀 8.离心获得沉淀，70%乙醇洗3次。干燥沉淀（不要太干，否则DNA不易溶解）。 9.加入200μL TE缓冲液，溶解DNA； 10.上清液就是所需的目的基因DNA。 参考：《分子生物学实验指导》（第二版） 高等教育出版社 主编：魏群;聚合酶链式反应（PCR）;基因组DNA;PCR技术的创建;Kary B. Mullis（1944－）;三篇重要论文;生物样品;基因组DNA;引物;94℃变性;94℃;Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus);72℃;TaqDNA聚合酶的发现，使整个PCR过程更加的简单化，让整个反应省事、省力、省财。 不用在关键环节（变性-褪火-延伸重复）不断的加入反应底物。 ;PCR技术的原理;加热;PCR扩增原理;2 PCR技术的特点;2 ）特异性;引物设计原则： （1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。;3）操作简便易行;PCR的反应体系和方法; 总体积 50-100 ?l Buffer 缓冲液 dNTP 原料 Primer 引物 DNA分子 模板 Taq酶 DNA聚合酶 ;PCR技术的基本过程(1);PCR技术的基本过程(2);琼脂糖凝胶电泳;1）PCR反应成分;（2）引物浓度 0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 ?l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。;（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性。;（5） Mg2+;2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 94oC 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 ;（3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加;经典循环参数（500bp以内）;全新4通道实时荧光定量PCR仪;PCR技术的应用;大肠杆菌;5’;GTCC;2)基因检测;遗传病的诊断 ;A;ASO探针法;探针杂交;PCR-RFLP法：;突变;正常; ; PCR-SSP;4