生物显微技术 第四章 免疫组化精品.ppt

阳性对照 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，对照切片应呈阳性结果，称为阳性对照。证明全过程均符合要求，尤其当待检标本呈阴性结果时，阳性对照尤为重要。 阴性对照 没有信号出现的检测结果。当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。 用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果； 用没有交叉反应的抗体代替特异性抗体进行实验。 用特异性抗体的抗血清与特异性抗体与切片共同孵育； 免疫细胞化学结果的判断 判断特异性染色和非特异性染色。 要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验。 重复 免疫组化检测action蛋白在大鼠卵巢组织中的表达。请选择抗体组合，设计实验。 人抗大鼠action（同种型IgG ） 大鼠抗人action （同种型IgG ） 兔抗大鼠action （同种型IgG ） 生物素标记的兔抗人IgG 生物素标记的兔抗人IgM 生物素标记的人抗兔IgG 生物素标记的人抗兔IgM 碱性磷酸酶标记的卵白素 碱性磷酸酶标记山羊抗人IgG 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 免疫组织化学Immunocytochemistry ICC 免疫组织化学 免疫细胞化学又称免疫组织化学、其主要原理是用标记的抗体（或抗原）对细胞或组织内的相应抗原（或抗体）进行定性、定位或定量检测，经过组织化学的呈色反应之后，用显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察。 免疫细化学的基本理论 抗原抗体反应 标记化学反应 显色化学反应 抗原抗体反应 抗体是免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）。人类免疫球蛋白有五类，即IgG 、IgA、 IgM、IgD 及IgE。 人体内的五类 Ig之间的区别就在于其各自重链的氨基酸组成和抗原性不同。用小写希腊字γ（Gamma）、α(Alpha)、μ(Mu)、δ(Delta)、ε(Epsilon),分别表示IgG 、IgA、 IgM、IgD 与IgE的两条重链。 免疫组织化学特点 1.高度特异性　 2.敏感性高　 3．方法步骤统一　　 4．形态、机能和代谢密切结合　　 基本技术方法 抗体的制备 组织材料的处理 免疫染色 对照试验 显微镜观察 免疫组织化学分类 根据标记物的不同，免疫细胞化学技术可分为: 免疫荧光细胞化学技术 免疫酶细胞化学技术 亲和免疫细胞化学技术 免疫电子显微镜技术 免疫酶细胞化学 预先将抗体与酶连结，再使其与组织内特异抗原反应，经细胞化学染色后，于光镜或电子显微镜下观察分析的形态学研究方法。 酶的种类 辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase , HRP） 碱性磷酸酶（Alkaline phasphotase, ALP） 葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase, GOD） 酶的要求 酶催化的底物必须是特异、容易观察； 定位效果好； 易获得，最好有商品出售； 酶的催化活性（Turnover）高并且稳定； 酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性； 背景低：被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。 基本步骤 组织及切片制备 抗体的制备 切片封闭：血清等 与抗体孵育 加入显色底物显色 复染 观察 抗体制备 酶标抗体 酶标抗体技术是通过共价键将酶连结在抗体上，制成酶标抗体。再借酶对底物的特异催化作用显色。 非标记抗体酶法 酶桥法 抗过氧化物酶法（ PAP ） PAP法的评价 抗体活性高 灵敏度高：灵敏度是指ICC方法所能发现最少数量抗原而言。 背景染色低： 亲和免疫细胞化学技术 物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础 。 抗原与抗体 植物凝集素和糖类 生物素与抗生物素 葡萄球菌A蛋白与IgG 阳离子与阴离子 激素和受体等 亲和免疫细胞化学技术特点 亲合细胞化学引入免疫细胞化学后使其敏感性得到进一步提高，因此更有利于微量抗原（或抗体 ）在细胞或亚细胞水平的定位。 抗生物素—生物素免疫细胞化学染色法 基本原理 生物素 （Riotin）：是一种小分子的维生素 卵白素（Avidin）：又名亲合素，鸡蛋白中一种碱性蛋白。 生物素与卵白素之间有很强的亲合力，较之抗体对抗原的亲合力要高出100万倍，能够彼此牢固结合而不影响彼此的生物学活性。 生物素与卵白素都具有与其它示踪物质如荧光素、铁蛋白和过氧化酶等相结合的能力。 抗生物素—生物素染色法 1．抗生物素—生物素—过氧化酶复合物技术（Avidin Biotin –Peroxidase Complex technique, 简称ABC技术） 2．桥抗生物素—生物素技术（Bridged Avidin –Biotin technique, 简称BRAB技术） 3．标记生物素—抗生物素技术（Labelled A