第十七篇章基因工程.ppt

基因工程 Genetic Engineering;第一节 重组DNA技术又称DNA克隆或分子克隆 ;重组DNA技术的发展史;1928年Griffith的肺炎球菌转化实验; ??????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????;DNA作为遗传物质的第一个实验证据;相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系;A羊乳腺细胞 B羊未受精卵 ↓ 　　　↓ 取出细胞核 除去细胞核的卵 ↘ 融合 ↙ 显微注射 ↓ 电击融合 早期胚胎发育 ↓ 胚胎移植到C羊子宫 ↓ C羊分娩产下“多莉”与A羊同;关于克隆人;应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA (recombinant DNA) 。 ;生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等;（二）工具酶;重组DNA技术中常用的工具酶;限制性核酸内切酶(restriction endonuclease) ;与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;Bam HⅠ;来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。;有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。;名　　称　　 　识别序列及切割位点;（三）目的基因(target gene) ;（四）基因载体;克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。;载体的选择标准：;质粒 (plasmid);;; λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆） EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）;粘性质粒(cosmid); 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）;二、重组DNA技术基本原理; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;（一）目的基因的获取;化学合成法获取目的基因;基因组DNA文库构建 把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。 ;组织或细胞染色体DNA;限制酶切位点; 此外，还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒、细菌人工染色体（BAC）、P1源人工染色体（PAC）、酵母人工染色体（YAC）等都可用于基因组文库的构建。 它们的优点是可以插入更大片段DNA，但是稳定性一般较差，在大量复制的过程中容易出现缺失现象。操作也相对较困难。; 真核生物基因组DNA庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到目的基因片段。而cDNA来自反转录的mRNA，无冗余序列，通过筛选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。;mRNA ;DNA聚合酶链反应（PCR) ;“SCIENCE”确实在1985年发表了第一篇关于PCR的论文。但是，却拒绝了由穆利斯撰写的描述PCR技术的论文。编辑部给他回了一封标准的拒稿信： “这篇文章虽然通过了评审委员会的初选，但不幸的是，专家们对本文的评审结论并没有像对同时期拟录用的稿件那样积