生物化学-蛋白质讲义.ppt

四、蛋白质的沉淀反应2(方式3) 某些生物碱试剂（如苦味酸、钨酸、鞣酸、碘化钾等）及某些酸（三氯乙酸、水杨磺酸、硝酸等）与蛋白质结合成不溶性的盐沉淀。 沉淀条件应当是pH小于等电点，这样蛋白质带正电，易与酸根负离子结合成盐。 3．生物碱试剂与某些酸类沉淀蛋白质 四、蛋白质的沉淀反应2(方式4) 可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等能破坏蛋白质的胶体性质而使蛋白质沉淀。如酒精的消毒作用。 在低温条件下，变性进行较缓慢，可以用来制备蛋白质。其优点在于：不像盐析那样存在有大量盐类，必须经透析除去，而且有机溶剂很易通过稀释透析及蒸发等方法除去。 4．有机溶剂沉淀蛋白质 四、蛋白质的沉淀反应2(方式5) 将接近于等电点附近的蛋白质溶液加热可使蛋白质发生凝固而沉下。 鸡蛋煮熟后，本来流动的蛋清、蛋黄都变成固体样的东西了。这是蛋白质凝固作用应用于食品加工的典型例子。 5．加热凝固 五、蛋白质的变性和复性（变性1） 定义:以某些物理或化学因素的作用，使蛋白质严格的空间构象被破坏（不包括肽键的断裂），而引起蛋白质若干理化和生物学性质的改变。 影响蛋白质变性的因素:紫外线照射、加热煮沸、强酸、强碱、重金属盐和有机溶剂处理等。 原理:维持蛋白质二级、三级和四级结构的严格构象的力只是一些弱的次级键，它们很容易被破坏。 特点:天然构象被破坏，蛋白质失去了生物学活性。 五、蛋白质的变性和复性（变性2） 五、蛋白质的变性和复性（变性3） 五、蛋白质的变性和复性（复性） 复性:某些变性蛋白质，再除去变性因素后，可以重新获得其天然结构和生物活性，称为蛋白质的“复性”。 如有一些球蛋白被热或极端pH变性后，若缓慢冷却或缓慢恢复到正常pH时，将重新获得其天然结构和生物活性。 这种复性现象，即蛋白质折叠研究中的所谓“折叠”。 六、蛋白质的颜色反应1 1.双缩脲反应1 原理:蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键，因此也能起双缩脲反应，形成红紫色混合物。 应用:可以用此反应来定性测定蛋白质；也可在540nm处比色，定量测定蛋白质。 六、蛋白质的颜色反应1 2H2N－C －NH2 H2N－C－N－C－NH2＋NH3↑ 1800C O O H O 尿素 双缩脲 双缩脲 CuSO4+NaOH 紫红色物质 1.双缩脲反应2 六、蛋白质的颜色反应2 2.酚试剂（福林-酚试剂）反应 原理:蛋白质分子一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及磷钨酸还原成蓝色化合物（钼蓝和钨蓝的混合物） 应用:常用此反应来定量测定蛋白质含量。（考马思亮兰G-250法） 六、蛋白质的颜色反应3 含有芳香族氨基酸，特别是含有酪氨酸和色氨酸的蛋白质所特有的呈色反应。 蛋白质溶液遇硝酸后先产生白色沉淀，加盐则白色沉淀变成黄色，再加碱呈橙黄色。因为硝酸将蛋白质分子中的苯环硝化，产生了黄色硝基苯衍生物 3．蛋白质的黄色反应1 六、蛋白质的颜色反应3 3．蛋白质的黄色反应2 硝基酚（黄色） 邻硝醌酸钠（橙黄色） 六、蛋白质的颜色反应4 4．米伦反应 米伦试剂为硝酸汞、亚硝酸汞、硝酸和亚硝酸的混合液。 当蛋白溶液中加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色。 由于酚类化合物有此反应，酪氨酸含有酚基，故有此反应。 六、蛋白质的颜色反应 5．乙醛酸反应1 在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间就会出现紫色环。 凡含有吲哚基的化合物都有此反应，由于色氨酸含有类似结构，因此含有色氨酸或含色氨酸的蛋白质都有此反应。 六、蛋白质的颜色反应 5．乙醛酸反应2 六、蛋白质的颜色反应6 6．坂口反应1 原理:精氨酸分子中的胍基，能与次氯酸钠、或次溴酸钠及α－萘酚在氢氧化钠溶液中产生红色产物。 应用:此反应可以用来鉴定含有精氨酸的蛋白质，也可用来测定精氨酸的含量。 六、蛋白质的颜色反应6 6．坂口反应2 红色 六、蛋白质的颜色反应6 6．坂口反应3 第四节 氨基酸及蛋白质分离提纯1 无论是对蛋白质结构与功能的研究，或是生产人们所需要的蛋白质产品，都涉及蛋白质的分离纯化。 目前对蛋白质的制备，主要是从生物组织中提取分离。 一般的程序为： 前处理：组织、细胞破碎等。 粗分级：盐析、沉淀等。 细分级：层析、电泳等。 第四节 氨基酸及蛋白质分离提纯2 一、氨基酸的分析分离 二、蛋白质混合物的分离方法 三、蛋白质的鉴定 一、氨基酸的分析分离1 类型：分配层析法(包括柱层析、纸层析和薄层层析) 基本原理：所有的层析系统通常都由两个相组成，一个为固定相的或静相；一个为流动相或动相。 一、氨基酸的分析分离2 分配系数Kd ：混合物在层析系统中的分离，决定于该混合物的组分在两相中的分配情况，即分配系数： Kd=CA/CB CA，