170831免疫层析技术在乳品安全检测中的应用-食品安全.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * 荧光免疫层析技术（Fluorescence immunoassay） 以荧光物质为标记物； 将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感性相结合； 荧光物分子在特定条件下吸收激发光的能量后，呈激发态而极不稳定，在其迅速回到基态时，以电磁辐射形式释放出光能，发射出波长比激发光波长长或短的荧光，从而通过荧光检测仪器进行检测。 2、荧光免疫层析技术 性能指标 胶体金检测卡 荧光定量检测卡 灵敏度 — 相对较高 判读方式 肉眼判读 仪器判读 结果判读一致性 不同人判读结果稍有差异 结果判读不依赖于人 结果显示形式 阴性或阳性 定量数值 样本测试范围 只能判读阴性、1/2检测限、检测限的结果 能判读定量范围内任意浓度样本的定量值 自带定量曲线 — 直接加样即可读出定量结果 数据保存 人工输入判读结果做记录保存 软件记录仪器测试过的所有样本数据并自动保存，后台数据中心远程监控 与胶体金免疫层析技术比较分析 与ELISA检测方法比较 兼具胶体金检测卡和 ELISA 的优点，避免了大量的分离和洗涤步骤，适宜进行高通量和定量检测，并且同样具有简便、快捷、低廉等优点。 与UPLC-MS-MS的比较 维德维康荧光定量检测卡产品（乳品） 普通荧光免疫层析 间接竞争法： 在免疫层析过程中，有机荧光染料或荧光微球标记的抗体，与样品中的目标物结合形成Ag+荧光标记Ab复合物； 之后，游离的荧光标记抗体与T线位置上包被的抗原结合，从而荧光物质在T线聚集； 在激发光的作用下，荧光物质发射荧光，荧光信号的强弱目标物的含量相关。由此，依据荧光信号的强弱可实现对样本中目标物的定量检测。 常用的有机染料： 罗丹明 FITC(异硫氰酸荧光素) 花青染料 (如：cy3 和cy5) DAPI（4‘,6-二脒基-2-苯基吲哚） 量子点荧光免疫层析 量子点(Quantum dots, QDs)，是一种由Ⅱ-Ⅵ族（如 CdTe、CdSe、ZnS ）或Ⅲ-Ⅴ族（如 InAs、InP 等）组成的纳米颗粒。 较于传统的有机染料，其具有激发光谱宽、发射光谱窄且重叠小等优点； 单一光源激发，不同量子点所发出荧光不同，故可进行多组分检测。 量子点的荧光强度可比普通荧光染料高100 倍左右，灵敏度，且稳定性较好； 具有良好的生物兼容性，可与抗体、核酸等生物分子进行特异性的连接。 量子点CdSe和罗丹明6G染料激发光/发射光的比较 相比于罗丹明6G染料： 量子点的激发光（绿色短划线）波长范围较宽 量子点的发射光（绿线）基本上是对称的，且波长范围更窄。 时间分辨荧光免疫层析 将镧系元素螯合物或微球用作抗体或抗原荧光标记物；如铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Te) 镧系元素的荧光光谱有较大的Stokes位移，最大可达290nm； 激发光谱和发射光谱间不相互重叠； 发射光谱很窄，荧光寿命长； 上转发光免疫层析 利用UCP颗粒（稀土离子）作为荧光材料，通过连续吸收较低能量的长波红外光, 发射高能量的短波实现能量上转换，此现象称反Stokes 效应。 A2 S1 S2 A1 A3 优点 stocks位移大：200nm 发射光谱窄，颜色可调 光化学稳定性高 上转发光在自然界是不存在的，极大程度低降低样本自发荧光的干扰 NaYF4是目前上转换发光效率最高的基质材料。 四、检测卡常见问题分析 1、T线浅或没有，样本的假阳性率高 人为操作原因，样本前处理未按照说明书操作； 检测卡失效； 温度原因，温度过低造成； 环境湿度大，试剂造成降解； 样本差异性，不同地区的样本之间差异性可能比较大。 应对方案：严格按照说明书操作；检测卡保存在适宜的环境中；注意检测卡有效期；样本检测在适宜的温度条件下进行等； 2、阳性样本检验不出，假阴性率高 混淆同一产品的不同型号； 未使用规定配套的稀释液； 试剂失效；加样量未按照说明书；未在规定时间内读取结果； 应对方案：重新确认检测卡的检测限和灵敏度；确保使用与产品型号相对应的稀释液或是相应的前处理方法；按照说明书加上样量，并在规定时间内读取结果。 3、加样后液体无法正常上吸到吸水垫处 未按照说明书方法进行稀释；未使用配套的稀释液；加样量过少； 应对方案：按照说明书方法使用配套的稀释液进行稀释；按照说明书加上样量； 检测卡（条）使用的注意事项 在做实验值之前，实验人员仔细阅读产品说明书； 使用前先将产品恢复至室温（25±2℃），但要避免长时间暴露在潮湿和光照的环境下，试纸条开封后1h内使用； 不要混用来自不同批号的试纸条和金标微孔； 应避免延误将试纸条的检测时间，以保证各样品孵育时间一致； 开封后的试纸条每次取出试剂一定要第一