氨基酸的分析分离.pptVIP

3.3离子交换层析 3.3.1原理 在一定情况下，离子交换剂吸附物质的量和在溶液中游离的物质量达到平衡时，二者物质的质量之比称为分配系数（平衡常数），以 Kd表示： Kd＝Ms/M Ms 单位重量的离子交换剂 Ml 单位体积溶液中溶质的摩尔数 设溶液中存在着A、B两种物质，当它们进行离子交换色谱时，原来吸附在离子交换剂上的离子被高浓度的A、B物质交换并被洗脱下来。由于A、B两种物质在同一溶液中的解离度不同，它们的电荷有差异，因此二者的迁移速度不同。由上样的起始点(原点)至A、B两组波峰的间距加大，最终形成两个波峰。 2.1.2凝胶排阻层析 (1)原理： 凝胶排阻色谱( Exclusion chromatography)，也称为分子筛层析、凝胶过滤层析。凝胶排阻色谱介质是以不同浓度的凝胶交联聚合而成的多孔径的，网状结构的球体。在色谱柱内不同大小凝胶的孔径可以通过不同大小的蛋白质分子。因此，凝胶排阻色谱介质对蛋白质分子具有排阻作用。在凝胶排阻色谱分离的分离过程中，大分子先流出，小分子后流出。 (2)蛋白质分子形状： 蛋白质分子一般有两种形状，一种是球形分子，另一种是线性分子。在色谱过程中，大分子不能进入或不能完全进入凝胶内部孔径而沿凝胶颗粒之间的空隙向前移动，迁移距离短，最先流出柱外来。小分子可以进入凝胶内部孔径慢慢向前移动，迁移距离长，最后流出柱外来。线性蛋白质分子与球形分子比较，同样大小分子量的蛋白质，线性分子体积大流速快，球形分子体积小流速慢。因此，在凝胶色谱柱中无论是球形分子还是线性分子都可进行分离，但是球形分子比线性分子的分离度好。 (3) 凝胶层析介质 凝胶层析介质主要有五类Sephadex, Bio?gel, Sepharose, utrol gel, perfuson等。 A、葡聚糖凝胶(Sephadex) 葡聚糖凝胶是以葡聚糖为原料合成的珠状凝胶，其主要技术指标 介质规格 溶胀体积(ml/mg) 球形分子量范围(Da) Sephardex G-10 2-3 700 Sephardex G-25 4 1000-5000 Sephardex G-50 6 1500-30000 Sephardex G-75 10 3000-80000 Sephardex G-100 15-20 4000-100000 Sephardex G-200 20-25 5000-250000 ? 后面的阿拉伯数字越大，表示交联越小，凝胶孔径越大，分子量分离范围越大。凝胶的溶胀体积。 凝胶性能： 耐高温100℃ 沸水煮 pH范围pH2?11稳定 在高盐浓度下体积易收缩 B、聚丙烯酰胺凝胶(Boi?gel) Bio?gel是由丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺交联制成的球状凝胶色谱介质。根据溶胀性质可分Bio?gel 、P?2、P?4…… P?300等10种。其主要技术指标是： 介质规格 溶胀体积(ml/mg) 球形分子量范围(Da) Bio-gel P-2 3.8 200-2000 Bio-gel P-4 5.8 500-4000 Bio-gel P-6 8.8 1000-5000 Bio-gel P-10 12.4 5000-17000 Bio-gel P-30 14.9 20000-50000 Bio-gel P-60 19.0 30000-70000 Bio-gel P-100 19.0 40000-100000 Bio-gel P-150 24.0 50000-150000 Bio-gel P-200 34.0 80000-300000 Bio-gel P-300 40.0 100000-400000 “P”后面的拉伯数字越大，表示吸水性越大，凝胶的交联度越小，分子量分离范围越大与 Sephadex相似。 性能 ： 刚性好流速快 在pH 2-11的溶液中稳定 高温下酰胺基易被水解产生羧酸 对酸、碱性较强的物质及芳香族化类合物均用不同程度的吸附。 琼脂糖凝胶Sepharose系列 琼脂糖凝胶是由琼脂糖经特殊工艺制成的珠状凝胶，琼脂糖中凝胶的结构是氢键而不是共价键，因此,物理稳定性较差。通常把琼脂糖凝胶层析介质浸泡在水溶液中。其主要技术指标是： 型号 凝胶浓度(w/v) 分子量分离范围 sepharose 2B 2 5×105?15×107 sepharose 4B 4 2