7 用正交法测定蔗糖酶活性影响因素（限定性设计） .pptVIP

实验七 用正交法测定几种因素 对蔗糖酶活性的影响 * * 丁鸣 （半自主性设计实验） 一、实验目的和要求 1. 初步掌握正交试验设计法的使用。 2. 运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度和pH值这四种因素对酶活力的影响。 二、实验基本原理 酶的催化作用是在一定条件下进行的，它受多种因素的影响，如酶浓度、底物浓度、温度、 pH值、抑制剂和激活剂等都能影响酶催化的反应速度。通常在其他因素恒定的条件下，通过某一因素在一系列变化条件下的酶活性测定求得该因素的影响，这是单因素的试验方法。对于多因素的试验可以通过正交试验设计法来完成。正交法是借助于正交表，简化的表格计算，正确分析结果，找到实验的最佳条件，分清因素的主次，这样就可以通过比较少的实验次数达到好的实验效果。实践证明正交法是一个多、快、好、省的方法。目前已广泛用于工农业生产和科学实验中。 本实验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度、pH值这四个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和pH值时酶的活性最大。 三、实验材料与试剂 1、实验材料 纯化的蔗糖酶（样品Ⅳ） 2、实验试剂 ⑴ 5%蔗糖（A.R.）溶液（W/V）； ⑵ 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH3.6、4.6、5.6； ⑶ 3,5－二硝基水杨酸试剂； 甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。 乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液. 甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。 四、实验器材与仪器 1. 试管及试管架； 2. 吸量管； 3. 恒温水浴箱 （37℃、50℃、65℃、100℃ ）； 4．可见光分光光度计。 五、实验操作方法和步骤 1、实验设计 ⑴、确定试验因素和水平 本实验取四个因素，即底物浓度[S]、酶浓度[E]、温度、pH值。每个因 素选三个水平，实验因素和选用水平如表1。 表1 因素、水平表 4.6 65 0.2 0.8 3 5.6 37 0.6 0.2 2 3.6 50 1.0 0.5 1 pH 温度 （℃） [E] （ml） [S] （ml） 因素 水平 作因素、水平表时，各因素的水平，最好不要按大小顺序排列。按一般方法，如对四个因素三个水平的各种搭配都要考虑，共需做34=81次试验，而用正交表只需做9次试验。 ⑵、选择合适的正交表 合适的正交表，是指要考察的因素的自由度总和，应该不大于所选正交表的总自由度。 正交表 Ln（ tq） L —— 正交表的代号 n —— 处理数（试验次数） t —— 水平数 q —— 因素数 试验次数 n = q( t–1 )+1= 4（3－1）+1＝9 总自由度 V总= n-1 各列自由度 V列 = K（该列水平数）–1 例如本实验选用四个因素，每个因素选三个水平，四个因素各占一列，那么四个因素的自由度分别为： V1 = 3–1 = 2， V2 = 3–1 = 2， V3 = 3–1 = 2， V4 = 3–1 = 2。 四个因素的自由度总和 = V1 + V2 + V3 + V4 = 8 因为各因素自由度总和是8，它没有超过L9（34）的总自由度= 9–1 = 8。所以选择正交表L9（34）是适合的。 3. 在所选的正交表上进行表头设计 由于本实验是一项四因素各三水平的试验，这样将四个因素依次放在 L9（34）的第1，2，3，4列上，这项把因素放入正交表头的工作，叫做表头设计。见表2。正交表都应具有以下两个特性： （1）在每一列中，各水平出现的次数相等。即在任何一列中，数字1和数字2和数字3都出现三次（几个水平就均出现几次）。 （2）任何两列中，横行组成的数对出现次数相等，均出现一次（这里有9个不同的数对，均出现一次） （1，1）、（1，2）、（1，3）、（2，1）、（2，2）、 （2，3）、（3，1）、（3，2）、（3，3），各出现一次。 以上这些特点保证了用正交表安排的试验计划是均衡搭配的，因此分析数据比较方便，可进行综合比较，结果比较可靠。在所选的正交表上进行表头设计，见表2。 1 2 3 3 9 3 1 2 3 8 2 3 1 3 7 2 1 3 2 6 1 3 2 2 5 3 2 1 2 4 3 3 3 1 3 2 2 2 1 2 1 1 1 1 1 4 pH 3 温度 2 [E] 1 [S] 水平