荧光定量PCR相关技术讲座2011-11.ppt

扩增曲线 -- Ct值： 模板DNA量越多，荧光强度达到检测域值所需的循环数越少， 即Ct值越小。 确定模板初始数量？ Real-time PCR: 检测原理 非特异性荧光标记： SYBR Green I 特异性荧光标记： 水解探针： TaqMan 非水解探针：Molecular beacon R Q Reporter Quencher R Q 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG 5’ 3’ 5’ 3’ SG SG SG SG Emission Excitation SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料。 SYBR Green I只与双链DNA结合才能发出荧光。 荧光信号的强度与反应体系中所有双链DNA分子成正比。 SYBR Green I 工作原理 Taqman 工作原理 在退火过程中，探针与靶序列结合 探针被Taq酶的5’- 3’ 外切酶活性剪切成片断 游离报告基团发出荧光 在延伸过程中，探针部分与靶序列分离 荧光信号强度与结合探针的DNA分子成正比。 染料法与探针法 对比 探针法 特异性高 --与探针与特异靶序列结合 对模板有选择性 --可进行多重PCR反应 成本高 --不同靶基因需要合成不同探针 染料法 通用性好 --对DNA模板没有选择性 使用方便，成本低 --仅需设计两个引物 有假阳性现象 --通过融解曲线判断 Real-time PCR 应用 基因表达分析 -- 相对定量：基因表达量的差异 -- 绝对定量：样本中核酸的量（拷贝数、微克） 基因型分析 -- SNP检测 等位基因检测 甲基化检测 基因表达分析检测 test sample 处理样本 target gene 目的基因 reference gene 内参基因 total RNA cDNA calibrator sample 对照样本 target gene 目的基因 reference gene 内参基因 qPCR 以各自样本中内参基因为标杆， 比较两样本中目的基因的相对丰度。 数据分析 qPCR cDNA total RNA 内参基因的选择 特点 选择内参基因 内参基因 beta-actin、 GAPDH、 18S rRNA、 28S rRNA等 -- 文献检索 -- 实验筛选 选择多个备选内参基因，以备选内参基因的几何平均数作为均一化标准 内参基因Housekeeping Gene -- RNA抽提、反转录为cDNA的效率不同，用于定量分析的样本初始浓度不同。 对样本初始浓度差异进行均一化校正。 不同环境，不同器官、组织、细胞类型之间，表达量相对恒定。 Housekeeping Gene 康为产品 不同丰度： 高丰度 ACTB、GAPDH 中等丰度 beta2M 低丰度 HPRT1 不同物种： 人、大鼠、小鼠、猪、牛、羊、鸡、斑马鱼、甘蔗 等 基因表达分析检测 样本处理与 RNA提取 – cDNA – qPCR 内参基因(housekeeping gene)选择 样本处理与RNA提取 外界刺激 – 10分钟 – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 – 2分钟内 –固定、裂解细胞 RNA样本保存液 Trizol 超纯RNA提取试剂盒 RNA的评价与鉴定 - 完整性 - 纯度 小心DNA污染！ 使用DNaseⅠ 引物设计 以RNA作PCR阴性对照 CW0580 CW0592 CW0581 CW2090A RT-qPCR一步法还是两步法？ 两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留，检测多个基因，便于反应条件的优化。 推荐：工作的初期阶段，以及单个样本多个靶基因检测。 一步法：简单、灵敏度高，有效减少实验操作误差和污染。每次只能做一个基因。 推荐：工作的成熟阶段，以及多个样本单个靶基因检测。 逆转录 逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？ 逆转录酶 SuperRT 逆转录酶（RNase H-） HiFi-MMLV逆转录酶（RNase H-） 引物 特异性 反应效率 Oligo dT 中 低 Random hexmer 低 中 Specific primer 高 高 CW0741 CW0743 总原则与普通PCR相同： 避免引物二聚体，避免二级结构 扩增片段长度（80 – 300 bp) 推荐做跨intron设计 引物设