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RNA提取Week 6 RNA提取 RNA提取纯化目的 RNA提取纯化原理 RNA提取纯化的实验流程 RNA的评价与鉴定 实验目的 了解RNA相关操作中的注意事项 掌握Trizol法提取组织总RNA的原理及提取的方法 了解RNA评价鉴定的相关指标 注意事项 1、全程佩戴一次性手套! 防止皮肤RNA酶污染； 2、研钵、钥匙160℃ 烘箱高温灭菌4h； 3、超净工作台紫外灭菌1.5h，枪头、离心管高压灭菌。 * 实验材料 大叶藻 细胞裂解原理 Trizol法即异硫氰酸胍-苯酚法 细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解 在核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放 RNA分离纯化，DNA和RNA不同pH溶解度不同 RNA沉淀 实验步骤 1、取100mg样品，液氮研磨充分,加入1mL Trizol, 涡旋混匀，室温下放置5min,裂解。 2、向裂解液中加入200?L氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3min，4℃，12000rpm,离心15min 。 3、取上清液（400?L）于另一离心管中，加入400 ?L异丙醇混匀，冰上放置15min，4℃，12000rpm, 离心10min 。 4、弃上清，RNA沉于管低，加入75%乙醇1mL，温和震荡，悬浮沉淀。 5、4℃，12000rpm,离心15min，弃上清，在超净工作台中风干5-10min。 6、加入30?L的DEPC水溶解沉淀。 RNA的评价与鉴定 1、1.0%琼脂糖凝胶检测 检测RNA的完整性 2、核酸蛋白定量仪测 检查RNA的纯度 1.0%琼脂糖凝胶检测 原理：琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定核酸的常规方法。核酸是两性电解质，其等电点为pH2-2.5，在常规的电泳缓冲液中（pH约8.5），核酸分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定： （1）DNA的分子大小；（2）DNA分子的构象； （3）电源电压； （4）离子强度影响 溴化乙啶(Ethidium bromide, EB) 能插入DNA分子中形成复合物，在波长为254nm紫外光照射下EB能发射荧光，而且荧光的强度正比于核酸的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估算出待测样品的浓度。由于溴化乙啶有致癌的嫌疑， 所以现在也开发出了安全的染料，如Sybergreen。 操作方法： 制备琼脂糖凝胶：按照被分离DNA分子的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量；一般情况下，可参考下表： 凝胶浓度（%） 线性DNA长度（bp） 0.5 1000～30000 0.7 800～12000 1.0 500～10000 1.2 400～7000 1.5 200～3000 2.0 50～2000 1．制备琼脂糖凝胶：称取琼脂糖，加入1xTAE电泳缓冲液，待水合数分钟后，置微波炉中将琼脂糖融化均匀。在加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液；加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。 2．胶板的制备：将胶槽置于制胶板上,插上样品梳子,注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙，待胶溶液冷却至50℃左右时，轻轻倒入电泳制胶板上，除掉气泡；待凝胶冷却凝固后，垂直轻拔梳子；将凝胶放入电泳槽内，加入1x电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶面；3．加样：点样板或薄膜上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样前要先记下加样的顺序和点样量）。4．电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5V/cm。样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低。当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳。5．观察和拍照：电泳完毕，取出凝胶,EB染色。在波长为254nm的紫外灯下观察染色后的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的桔红色荧光条带。 呈现出3条rRNA带，分别是5s、18s、28s rRNA的带。 28s亮度是18s亮度的二倍。 核酸蛋白定量仪检测 OD260/230