癌基因与基因重组推荐.pptVIP

抗氨苄青霉素基因 抗四环素基因 载体克隆载体（ 质粒） 存在细菌染色体外环状DNA 独立自主复制 含有抗药基因 抗氨苄青霉素基因 抗四环素基因 含有多个RE位点供外源基因插入 * 原核表达载体 pET42b（+）-RGN * * 克隆载体 质粒 表达载体 （原核） 克隆载体 复制起始点 多接头克隆位点（外源基因和载体正确连接） 选择标记 强启动子 核糖体结合点（SD序列） 翻译起始点 转录翻译终止信号 * 限制性内切酶 是一类能识别和切割双链DNA分子 中特定碱基顺序的核酸水解酶 识别的 DNA序列多为4-6个碱基 识别的序列都具有回文结构 切割后产生平齐末端和粘性末端 HpaI 5’GTTAAC 3’ 3’CAATTG 5’ 5’GTT AAC 3’ 3’CAA TTG 5’ 目的基因与载体连接 * 外源基因与载体的连接（DNA连接酶） 粘性末端连接 同一限制性内切酶位点连接 不同限制性内切酶位点连接 平端连接 同聚物加尾连接 人工接头连接 外源基因与载体的连接 * * * 重组DNA技术中常用的的工具酶 工 具 酶 功 能 限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA DNA连接酶 催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 DNA聚合酶Ⅰ 合成双链cDNA分子或片段连接 缺口平移制作高比活探针 DNA序列分析 填补3′末端 Klenow片段 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5??3?聚合、3??5?外切活性，而无5??3?外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3?末端标记等 反转录酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5′羟基末端磷酸化，或标记探针 末端转移酶 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 碱性磷酸酶 切除末端磷酸基 * 分子杂交与印迹技术 原理 利用核酸变性/复性进行DNA/RNA 定性、定量分析 分子杂交 探针（单链，已知序列，可检测） 杂交 印迹在固化介质上的核酸（单链） 印迹技术 凝胶分离的生物大分子 转移(印迹)或直接放在固化介质上 加以检测、分析 探针技术 探针： 经过标记的核酸片段 与待测的核酸片段互补 可用于检测核酸样品中特定的基因 筛选、鉴定重组体克隆 * 印迹技术类别和应用 DNA印迹技术 （Southern blotting） 基因组DNA定性、定量 DNA探DNA RNA印迹技术 （Northern blotting） RNA定性、定量 DNA探mRNA 蛋白质印迹技术 （Western blotting） 利用抗原-抗体反应进行 蛋白质定性、定量 原位杂交/DNA芯片技术 Chip technology allows detailed comparisons of related animal cells to determine (for example) the differences in expression between a normal cell and a cancer cell. * * 染色体点突变和缺失 * * （二）抑癌基因 抑癌基因 抑制细胞过度生长、增殖 （负调节细胞周期） 从而遏制肿瘤形成的基因 作用机制 正常： 控制细胞生长的负调节基因 与负责调节生长的原癌基因协调表达 维持细胞的正常生长、增殖与分化 异常： 抑癌基因缺失/突变 丧失抑癌作用，具备促癌效应 RB基因 p53基因 * 基因 染色体位置 表达产物 肿瘤 Rb 13q14 G1期检查点，细胞分化 视网膜母细胞瘤，肉瘤 WT1 11q13 转录因子 Wiloms肿瘤 p53 17q13 转录因子 乳腺癌，神经胶质瘤，肉瘤 NF1 17q11 激活Ras-GTPase 神经胶质瘤，肉瘤 NF2 22q12 在细胞膜-细胞骨架内表面 神经鞘瘤 VHL 3p25 细胞膜蛋白 嗜铬细胞瘤，肾癌 APC 5q21 细胞质蛋白因子 结肠癌 DCC 18q21 细胞附着因子 结肠直肠癌 * 1、Rb 基因 和 p53 基因 Rb基因 第一个被发现的抑癌基因 视网膜母细胞瘤，抑癌基因RB （-） Rb基因位于第13号染色体长臂13q14 表达产物Rb蛋白 DNA结合蛋白 （-）细胞周期G1期 ?Rb is a tumor suppressor that controls the cell cycle * * * p53 基因 第二个被发现的抑癌