第三章免疫学检测技术推荐.pptVIP

* * * 免疫学检测 封闭 加一抗 洗膜 加二抗 洗膜 加底物 试验记录 摇育过夜 摇育2h （3次，每次10min ） 摇育1h * 二、操作过程 1. SDS电泳 2. 电转移： 将冷却管接上水龙头，接上电源，根据凝胶面积调节电流（0.65mA/cm2），时间2小时。 3. 电转移结束后，打开夹板，剪下NC膜左右上角做标记（即标记有蛋白结合面）。然后把NC膜分为两份，其中一份放入氨基黑染色液中染色30～60秒，10％乙酸漂洗，观察膜上有无蛋白条带。 如果有，可用另一份继续以下的实验。 * * 4. 封闭： （将NC膜上无蛋白结合处封闭，防止探针的非特异性结合）在一培养皿内倒入封闭液（5％脱脂奶粉），将未染色的NC膜放入浸泡，室温放置1小时。 5. 探针结合：封闭结束后，用PBS漂洗一次。倒干PBS后，加入HRP标记羊抗鼠IgG稀释液，37oC孵育1小时。 * 6. 孵育完成后，PBS漂洗三次（每次浸泡3分钟），将未结合探针尽可能洗掉。倒干PBS后，加入底物工作液，避光显色10分钟，观察颜色变化。 三、影响因素与对策 1、影响SDS的因素 2、影响蛋白转移的因素 转移膜的活化与大小、缓冲液、是否平整、有无气泡、电压、温度、转移时间等。 3、封闭 封闭试剂浓度不能过高过低。 4、显色 设立阴阳性对照，DAB显色后立即照相，否则易腿色。 * * 酶免疫技术按目的分类 （一）酶免疫组织化学测定技术 （二）酶免疫测定技术 Ab *＋Ag → Ab*Ag ＋Ab* Ab ＋Ag * → AbAg * ＋Ag* （1）Homogenous （均相测定） （2）Heterogenous（异相测定） —— Solid phase ——liquid phase 第四节 酶联免疫检测技术 * 一、ELISA的基本原理 ELISA(Enzyme-Linked immunosorbent assay)的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。这一方法的基本原理如下。 （1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性； （2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性．又保留酶的活性。 * 二、基本操作流程 测定抗原常用双抗体夹心法，测定抗体用间接法。 基本过程为： 固相包被（吸附已知成分、洗涤、封闭、洗涤） 加待测样品 促反应 洗涤 加酶结合物 促反应 洗涤 加酶底物 促反应 终止反应 测定（比色、荧光） * ELISA的类型： ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。用于这些目的的检测方法主要有以下几种类型。 1 双抗体(原)夹心法 2 间接法 3 竞争法 4 双位点一步法 5 捕获法测IgM抗体 6 应用亲和素和生物素的ELISA * ELISA的类型 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂（immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为结合物（conjugate）； （3）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。 * 1、夹心法 过程：包被 加待测样品 洗涤 加酶标记物 洗涤 加底物 测定 1）双抗体夹心法测抗原 此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原（二价及以上），例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。 * 2）双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。 * 2、间接法测抗体 1）间接测抗体法 传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。 * * 2）间接测抗原法 * 3、双位点一步法 测定抗原 由双抗体夹心改进而来，将双抗体夹心中针对同一抗原决定簇的2种抗体改为针对抗原不同决定簇的2种单抗。敏感性和特异性大为提高。 但抗原过量，Ag分别与固相抗体和酶标抗体结合，抑制夹心复合物形成，出现所谓钩状效应，甚至假阴性结果。 过程：Ab1