乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书.docxVIP

乙型肝炎病毒核酸定量检测标准作业指导书目的采用PCR技术、实时荧光探针技术，用于临床血清或血浆标本中的乙型肝炎病毒核酸的定量检测，或用于乙型肝炎的辅助诊断和抗病毒药物治疗中的疗效观察。范围适用于乙型肝炎病毒核酸（HBV DNA）定量检测（PCR-荧光探针法）。3. 职责3.1 操作人员：负责标本制备检测、仪器操作、报告发送。3.2 专业组组长：负责本组耗材的请购，监督本组标本检测、仪器操作、报告发送、质控管理等各方面工作。3.3 实验室主任：负责监督和指导实验室各方面工作。4. 原理采用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，在样品核酸纯化之后，通过荧光定量PCR对HBV DNA进行扩增，并检测荧光信号，仪器软件系统自动绘制出实时扩增曲线，根据阈循环值(CT)实现对未知样品的检测。另外，本试剂盒带有内标物质，用于对核酸提取的整个过程进行监控，减少假阴性结果的出现。5. 样品要求5.1 适用样品类型：血清或血浆。5.2 样品采集：5.2.1 血清用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的真空采血管中（未加抗凝剂），室温（22-25℃）放置30-60min血标本可自发完全凝集析出血清，或直接使用水平离心机，1500rpm离心5min，吸取上层血清，转移至1.5ml灭菌离心管。5.2.2血浆用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂的真空采血管，立即轻轻颠倒混匀5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，5-10min后分离血浆于无菌的1.5ml灭菌离心管。5.3 样品保存和运送使用专用样品0℃冰壶送检，温度约维持在4℃左右。分离后的血清或血浆可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。5.4 拒收样品：拒绝重度溶血样品、肝素抗凝的血浆。6. 仪器和试剂6.1 仪器AB7500核酸扩增仪、恒温金属浴、生物安全柜、低温离心机等。6.2 试剂生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司产品标准批号：YZB/国 7265-2013线性范围：100 IU/ml-5×108 IU/ml最低检出限及定量限：最低检出限浓度为 30 IU/ml，最低定量浓度为100 IU/ml。试剂各组分见表1：表1 试剂盒组分表组 分 名 称规 格数 量核酸提取试剂DNA提取液Ⅰ4.5 ml/瓶2质控品及阳性定量参考品阴性质控品250 ul/管1HBV强阳性质控品250 ul/管1HBV临界阳性质控品250 ul/管1HBV阳性定量参考品（2.0×106 IU/ml）250 ul/管1HBV阳性定量参考品（2.0×105 IU/ ml）250 ul/管1HBV阳性定量参考品（2.0×104 IU/ ml）250 ul/管1HBV阳性定量参考品（2.0×103 IU/ ml）250 ul/管1PCR检测试剂PCR内标溶液100 ul/管1HBV PCR反应液270 ul/管2Taq酶60 ul/管17. 操作步骤7.1 试剂准备（试剂储存和准备区）7.1.1 进入试剂准备区，打开通风设备，按照消毒清洁程序擦拭实验台面。7.1.2 取出N个（N=待测样品数+8 =待测样品数+ 4个HCV阳性定量标准品+HCV强阳性质控品+HCV临界阳性质控品+阴性质控品+空白孔）PCR反应管，HBV单人份扩增体系配制如下表2：表2 反应液配制表组分HBV反应液Taq酶总体积用量/人份27 ul3 ul30 ul将各组分充分混匀，混合好后进行瞬时离心将管壁上的液体全部离心至管底，之后将30 ul扩增体系分装到PCR反应管，反应液分装时尽量避免产生气泡，盖紧管盖，经传递窗传递到标本制备区。7.2 DNA提取（标本制备区）7.2.1 进入标本制备区，从传递窗中取出PCR反应管， 将其放入标本制备区冰箱冷藏。7.2.2 从冰箱取出待测样品、阴性质控品、强阳性质控品、临界阳性质控品、DNA提取液Ⅰ和内标液，放入生物安全柜内室温溶解，备用。7.2.3 打开金属浴，调节温度为100℃，使仪器自动升温。7.2.4 用镊子夹取按需要量准备的1.5 ml灭菌离心管放于安全柜内离心管架上，所需离心管数为样品数+8。7.2.5 向离心管中各加入450 ul DNA 提取液Ⅰ和4 ul内标溶液，再按编号加入200 ul样品，离心管与样品对应编号，每个离心管的编号方向都要朝向管口开启的方向。用振荡器剧烈震荡混匀15s，瞬时离心数秒。7.2.6 将离心管放入金属浴，100℃恒温处理10±1 min。（摆放离心管时，离心管开口要背向人放置。）7.2.7 温育10min后，用镊子从金属浴中取出所有离心管，室温静置冷却。12000g，离心5min，备用。（摆放离心管时要将离心管开口朝向内侧。）7.2.8 从标本制备区冰箱冷藏