分泌性hiv1nefegfp融合蛋白表达载体的构建与鉴定-江苏大学.pdfVIP

第２２卷第１期 江 苏 大 学 学 报（医学 版） Ｖｏｌ．２２ Ｎｏ．１ 　 ２０１２年１月 　 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＪｉａｎｇｓｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＭｅｄｉｃｉｎｅＥｄｉｔｉｏｎ） Ｊａｎ．２０１２ 　 　 　 　 　 　 分泌性 ＨＩＶ１ＮｅｆＥＧＦＰ融合蛋白表达载体的构建与鉴定 郝婷婷，马新廷，朱小飞，卢春 （南京医科大学微生物与免疫学系，江苏 南京２１００２９） ［摘　要］　目的：构建含有人类免疫缺陷病毒Ｉ型（ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓｔｙｐｅＩ，ＨＩＶ１）负性调节因子（ｎｅｇａ ｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ，Ｎｅｆ）和增强型绿色荧光蛋白（ｅｎｈａｎｃｅｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ，ＥＧＦＰ）基因的重组融合蛋白分泌 性表达载体，并检测该融合蛋白在真核细胞中的表达及其在培养上清中分泌情况，为进一步研究Ｎｅｆ功能奠定基础。 方法：利用ＰＣＲ扩增出ＨＩＶ１Ｎｅｆ和ＥＧＦＰ基因，插入到分泌性表达载体ｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ中。构建的ｐＳｅｃＴａｇ２ＢＮｅｆＥＧＦＰ 融合蛋白表达质粒，转染２９３Ｔ细胞，荧光显微镜下观测细胞中ＮｅｆＥＧＦＰ融合蛋白的表达。收集细胞及上清液，蛋白 质印迹和ＥＬＩＳＡ法分别检测ＮｅｆＥＧＦＰ融合蛋白的表达及其分泌。结果：限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列测定证 实，成功构建了含有ＮｅｆＥＧＦＰ基因的分泌性表达载体，该质粒转染２９３Ｔ细胞后，蛋白质印迹法能够检测到ＮｅｆＥＧＦＰ 融合蛋白的表达条带，ＥＬＩＳＡ法检测上清液中目的蛋白分泌量为１．７ｎｇ／ｍｌ。结论：成功构建含有 ＮｅｆＥＧＦＰ的融合 蛋白表达质粒，融合蛋白ＮｅｆＥＧＦＰ在２９３Ｔ细胞中获得表达，并能分泌到胞外。 ［关键词］　分泌性表达载体；人类免疫缺陷病毒Ｉ型负性调节因子；增强型绿色荧光蛋白；融合蛋白 ［中图分类号］　Ｒ３９２．１１　　［文献标志码］　Ａ　　［文章编号］　１６７１－７７８３（２０１２）０１－００１４－０５ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｓｅｃｒｅｔｏｒｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＨＩＶ１ＮｅｆａｎｄＥＧＦＰｇｅｎｅ ＨＡＯＴｉｎｇｔｉｎｇ，ＭＡＸｉｎｔｉｎｇ，ＺＨＵＸｉａｏｆｅｉ，ＬＵＣｈｕｎ （ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＮａｎｊｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＮａｎｊｉｎｇＪｉａｎｇｓｕ２１００２９，Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｓｅｃｒｅｔｏｒｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓｔｙｐｅＩ（ＨＩＶ１）ｎｅｇａｔｉｖｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ（Ｎｅｆ）ａｎｄｅｎｈａｎｃｅｄｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ） ｇｅｎｅ，ａｎｄａｐｐｒａｉｓｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＮｅｆＥＧＦＰｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｃｅｌｌａｎｄｔｈｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｉｎｔｏ ｔｈｅｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅＮｅｆａｎｄＥＧＦＰｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ，ｔｈｅｎｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｔｈｅｓｅｃｒｅ ｔｏｒｙｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｖｅｃｔｏｒｐＳｅｃＴａｇ２ＢＮｅｆＥＧＦＰｗａｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅ ２９３Ｔｃｅｌｌｓ，ｏｂｓｅｒｖｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＦＰ，ｔｈｅｎｈａｒｖｅｓｔｅｄｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａａｎｄｃｅ