免疫组化技术及注意事项.pptVIP

阳性对照 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫组织化学染色，对照切片应呈阳性 自身对照 同一切片上，不同组织成分或不同部位或神经核中的阳性或阴性结果与检测的目的物对照比较。如应为阳性的组织或部位是阳性，则免疫组化技术正确，如为阴性，则表明染色技术有问题或免疫试剂质量有问题。 替代对照 PVN中Fos表达 3、免疫组化正式实验 3.1 步骤 组织固定 冰冻切片 阻断内源性酶 封闭处理 一抗处理 二抗处理 显色复染 脱水透明封片 3.2 注意事项 组织固定 保持细胞固有形态和结构，保存组织细胞的抗原性 固定液的选择 ：免疫组化技术成功与否的基础。不同抗原稳定性各不相同，对固定液的耐受性差异较大。可作多种固定液对比，从而选出理想的固定液。常用中性缓冲多聚甲醛液。另有Bouin’s液、Zanboni’s液、Karnovsky’s液 组织固定时间：最好在l2h内，一般不应超过24h。随着固定时间的延长，组织抗原的检出强度将逐渐降低 固定方法：浸入法和灌注法 去除生物体自身含有的内源性酶 灭活碱 (酸)性磷酸酶：左旋咪唑 (24mg/mL)加入底物液中并保持pH7.6~8.2能除去大部分内源性碱性磷酸酶，酸性磷酸酶可用0.05mol/L酒石酸抑制。 去除内源性过氧化物酶：0.3~3％过氧化氢甲醇液孵育10~30min。甲醇对各种酶，都有钝化的作用。 去除内源性生物素 正常组织细胞中含有生物素，特别是肝、脾、肾、脑，皮肤等组织中，在应用亲和素试剂的染色中，内源性生物素易结合卵白素，形成卵白素一生物素复合物，导致假阳性 采用生物素方法染色前，将组织切片浸于0.01%卵白素溶液室温处理20分钟，使其结合位点饱和，以消除内源性生物素的活性。 合理地使用封闭试剂 一抗孵育前，常常加入非免疫动物血清，以减少背景的染色，因为抗体是高度的电荷分子，可能与带有相应电荷的组织成分非特异性地结合 要消除电荷吸附所造成的非特异性背景染色，可用二抗动物的2~10%非免疫血清或1~2%牛血清白蛋白，以封闭吸附位点 抗体的配制 根据一次实验所需的抗体量来决定配制的抗体量。 配制抗体的微量取样器一定要准确，最好专用。 根据抗体的使用说明书配制，一般可加去垢剂 如TritonX-100、 Tween-20等 一抗孵育可在4℃过夜，或室温或37 ℃几小时 PBS的冲洗 冲洗的PBS为一次性，防止交叉污染 温柔冲洗，冲洗时间足够，一般冲洗3~5次 PBS的pH和离子强度的使用和要求 ，中性及弱碱性条件 (pH7-8)有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解 显色系统 辣根过氧化物酶 (HRP)：DAB或AEC显色 DAB配制完后最长放置30 min，DAB显色最长不宜超过10 min。 增强显色的方法：应用金属离子或有机复合物溶剂在显色液中可增强DAB的显色效果。包括铜、锇、银、钴、镍、及米唑等。加入1％重金属离子 (1：50)，可使显色明显增强，并发生变色反应。以Ag、Co、Ni离子最好。 AEC显色系统的鄙端是易溶于有机溶剂，封片以水性封片剂为主，染色切片不能久存。 碱性磷酸酶 (AP)：最好选用NBT/BCIP，而AP-Red、AP-Qrange、Fas-Red染色结果均不能长期保存 3.3 ?非特异性染色的出现???逐一查找原因? 是否有效地去除内源性酶 非免疫血清封闭是否正确 一抗要合适，过高的浓度极易出现非特异性 每步的冲洗是否干净 组织切片在操作过程中是否曾经干涸 DAB配置、使用、浓度是否准确 检测系统是否与组织内源性蛋白有交叉反应 4、免疫组化阳性结果的统计 Image-Pro Plus的主要用途是分析测量图象 照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。处理目标是通过测量图片中黄色部分的黄度来反映相应蛋白表达的的量 4.1 校正光密度 图片的光强单位与测量中的光密度单位的不一致 计算机图片格式中，纯黑的点的“亮度”为零，其灰度gray=0；纯白点的“亮度”为255，其灰度gray=255 光密度OD值：为吸收光线物质的光学密度 未校正前，IPP用的是gray灰度单位。浅色处灰度值大，深色处灰度值小 光密度校正的目的就是让照片上亮的、白的、染色浅的点的OD值显示为接近于零的小的数值，让暗的、黑的、染色深的阳性区域点的OD值显示为较大的数值 光密度分析时必须对程序系统的光密度值进行转换，从灰度数值转换为光密度数值单位 校正光密度的具体方法 点measure - calibaration – intensity 点窗口里的 new按纽，新建一个caliberation set，在下面点击std optical density。再点一下左上方的