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免疫组化注意事项 组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决上述的问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。 在免疫组化染色后的镜下观察中，有发现这样的结果，阳性物反应不强，时隐时现，表达不均匀，有时可出现假阴性，这是因为: 1.组织在用甲醛固定的过程中所形成的醛键可封闭抗原的决定族。甲醛与组织蛋白质类的反应是多样而复杂的，因为它能和多种不同的功能基团结合，在多数情况下在其间形成桥键8。这也是甲醛的一个作用，因为它是一种聚合固定剂，因而能在相邻的蛋白质键间形成桥键的作用。 2.甲醛在保存进程中会形成羟甲基，也可封闭抗原决定族。据French和Edsall的研究认为，最常遇到的甲醇反应，就是加到一个含反应性氢原子的化合物中，形成一个羟甲基化合物。 3.在组织固定过程中，甲醛与蛋白质发生交联，形成醛交联蛋白，这种化合物封闭了抗原，使之无法表达出来。 为了解决上述存在的问题，更好地暴露出抗原，将其很好地显示出来，目前世界上公认的方法就是必须进行抗原修复。 至今为止，抗原修复有许多种方法，在这些方法中，有的是根据抗体的要求来进行，有的是根据抗原的表达程度来进行，我们则对每种病例每项检测，都要求必须进行抗原修复，以达到抗原全面表达的最佳状态。 一、物理化学试剂抗原修复法。 1.真空负压抗原修复法: ①切片脱蜡至水。 ②0.3%H2O2甲醇真空负压处理5分钟。 ③自来水洗，蒸馏水洗。 ④0.01M柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)，真空负压干燥箱预先调至95℃，真空负压处理10分钟。 ⑤待修复注降至室温的一，PBS洗3次，随后按选好的免疫组化染色方法进行染色。 这是一种操作简单，效果特佳，温度恒定，能一次性处理大量切片的方法。该法的最大的特点有四:一是各物质的分子在失重的情况下四处飘游，增加各分子间的碰撞机会;二是有恒定的温度，既能使甲醛固定的蛋白发生变性，又不需要使抗原修复液达到沸腾，不会导致切片因抗原修复液的沸腾而离开载片，保证了染色的成功率，减少了因掉片而反复制片的麻烦，保证了病理报告的及时发生，为病人争取更多的时间;三是不受条件限制，不管是金属性的不是非金属的都可以进行操作;四是可以一次性制作大批的切片。 2.微波辐射抗原修复法: ①切片脱蜡至水。 ②0.3%H2O2甲醇处理10分钟。 ③自来水洗，蒸馏水洗。 ④0.01M柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)，于微波炉内微波辐射10分钟，如检测Er和Pr则需要20辐射分钟左右。 ⑤待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。 该法与上法相比，从实验结果看，都不分上下。它是利用微波每秒以24亿5千万次的快速运动产生瞬间热。当然，光靠微波的作用是不够的，还必须依靠热的作用，方能达到目的。应用微波辐射，它有双重作用，微波辐射可以使各物质分子作极性运动。促进形成的醛键断裂开。分子间运动所产生的瞬间热，当达到有效的温度后，就可导致甲醛固定后的蛋白的变性。该法的特点是:产热迅速，容易操作，也容易引起抗原修复液的沸腾，使用微波炉时禁止使用金属性的器皿，以防引起失火或爆炸。 3.高压抗原修复法: ①切片脱蜡至水。 ②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 ③自来水洗，蒸馏水洗。 ④切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1-4分钟。 ⑤待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。 该法高压和高热来促进醛键的断裂，当加热至开锅，加上高压阀后，汽体喷出，此时的温度已达121℃左右。该法被应用于一些较难修复的抗原，经多次实验认为，该法效果不错。 4.隔水热抗原修复法: ①切片脱蜡至水。 ②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 ③自来水洗，蒸馏水洗。 ④切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液(PH6.0)中，边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后(92℃↑)。即开始计时，持续40分钟。 ⑤待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。 该法应用隔水热方法，效果不及前面三种方法，它需要较长时间的热的作用，在早期应用于Er和Pr染色的抗原修复时，我们的修复时间为40分钟，如果达不到这时间，效果将不理想。 5.电炉加热抗原修复法: ①切片脱蜡至水。 ②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。 ③自来水洗，蒸馏水洗。 ④将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达92℃后，即可拔离电源，当温度低于92℃时，再插上电源，如此反复持续至10分钟左右。 ⑤待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后