第二章-基因工程的工具酶.pptVIP

第二章 基因工程的工具酶 基因工程的工具酶（instrumental enzyme of gene engineering）是应用于基因工程各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体DNA制备等所需要的酶类。 基因工程工具酶 1、限制性内切酶 2、甲基化酶 3、DNA连接酶 4、DNA聚合酶 5、RNA聚合酶 6、磷酸激酶和磷酸酶 7、核酸酶 8、核酶 一、限制性核酸内切酶 (restriction enzyme) 限制性内切酶的发现 限制性内切酶的分类 限制性内切酶的命名 限制性内切酶的活性单位 限制性内切酶的切割特点 限制性内切酶的反应条件 限制性内切酶的应用 1、限制性核酸内切酶的发现 E.Coli B含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 当λ(k)噬菌体侵染E.coli B时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。 而E.coli B的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 Eco B核酸酶不能识别已甲基化的序列。 仍有少量phage λ (K)可在 E. coli B中生存，是因为E.coli B phage 对λ (K)进行了修饰。 R-M系统 细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restriction-modification system)。 R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。 1968 Linn和Arber从E.coli B中发现限制酶Ⅰ 1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ 1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金 限制性核酸内切酶（限制酶）：在细胞内能够识别双链DNA分子中的特定核苷酸序列，并对DNA分子进行切割的一种酶。 功能：降解不同源DNA，而不降解同源DNA。 2.限制性核酸内切酶的分类 3.限制性核酸内切酶的命名 4.限制性核酸内切酶的活性单位 50μL反应体系中，含1μg底物DNA，于最适反应条件和温度下，保温1小时，能使1μg DNA完全降解所需的酶蛋白量即为一个酶单位，用U表示。 buffer （pH=8.0） ： 50mmol/L Tris-HCl 10mmol/L MgCl2 1mmol/L DTT或巯基乙醇 100μg BSA/ml （DDT：二硫苏糖醇 BSA：牛血清蛋白) 5.限制性核酸内切酶的切割特点 在DNA分子双链的特异性识别序列部位，切割DNA分子，产生链的断裂。 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相对。断裂结果形成的DNA片段，具有互补的单链延伸末端。 识别序列 绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。 识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种，它们都呈回文结构。 不同核酸内切酶的特异识别位点 核酸内切酶HindⅢ对双链DNA分子的切割作用 三种酶切末端 平齐末端（如SmaⅠ、AluⅠ、HaeⅢ） 同裂酶和同尾酶 同裂酶：来源不同的限制酶识别相同的核苷酸靶序列。产生同样的切割，形成同样的末端。 如：HpaⅡ和MspⅠ均可切割C CGG。 当胞嘧啶甲基化后， MspⅠ不能再切割。 同尾酶：来源不同，识别的核苷酸靶序列也不相同，但切割后DNA分子产生的粘性末端相同的限制性核酸内切酶。 BamHⅠ BclⅠ BglⅡ三种酶可产生相同的5’GATC粘性末端，由这种同尾酶产生的DNA片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。 6.限制性核酸内切酶的反应条件 1.底物 DNA （1）DNA纯度: RNA影响，影响酶活性的有机溶剂、离子 （2）DNA浓度: [DNA]过大，抑制酶活，影响酶分子扩散 如：4μg DNA/1U HPaⅠ 50μL 37℃ 15h 1μg DNA/1U HPaⅠ 50μL 37℃ 1h （3）识别位点及邻近位点特异性序列：如：pBR322 DNA 有4个NarⅠ切点(GGCGCC)，其中2个切点用1U酶水解1h完全切开，2个切点用50U酶水解16h水解不完全。