基因组精简优化研究进展 .pptVIP

2.5 基于多种敲除系统复合的基因组精简 利用各敲除系统的典型特点，综合多种敲除系统可建立更为理想和高效的基因组精简策略。 * 基因组精简优化的研究进展 学院：生环学院 专业：生物化工 姓名：刘东 * 2.微生物基因组精简策略 微生物基因组精简策略是构建合成生物学底盘细胞的关键所在，基因组精简主要基于： 同源重组 (Homologous recombination) 双链断裂修复 (Double strains break repair，DSBR) 重组 重组位点特异性重组 (Site-specific recombination) 转座重组 (Transpositional recombination) 噬菌体转导 (Transduction) 技术。 * 特点： 双链断裂修复重组和位点特异性重组均建立在同源重组的基础上，进一步实现基因敲除。 转导技术通过噬菌体侵染细胞，可以将各菌株的大片段突变型整合入1个受体菌中，提高基因组精简效率。 同源重组和双链断裂修复重组可实现无痕敲除，而位点特异性重组和转座重组会有碱基残留。 转座重组一般可循环敲除获得基因组精简菌株，其余重组可通过重复敲除或转导获得基因组精简菌株。 * 2.1 基于同源重组的基因组精简 同源重组是指两个DNA 分子之间同源区域交换实现序列重组的过程，并使得重组基因组稳定遗传。通过同源重组进行基因组精简时往往需要同时引入抗性筛选标记 (Positive selection marker) 和负筛选标记 (Negative selection marker)。 环形质粒：主要是指自杀质粒，其敲除主要基于宿主菌自杀质粒的同源交换。 线性质粒：主要基于Red 重组的同源交换。 * 2.1.1 基于自杀质粒的同源重组 特点：自杀质粒 (Suicide plasmid) 通常在宿主菌中不能复制，可通过其携带的同源臂重组整合到染色体上敲除目的基因 (图1A)。基因组精简时，可根据目标片段大小及重组效率选择合适的同源交换方式。 同源单交换：同源单交换在敲除过程中通过1个同源臂重组将整个质粒整合到基因组上。 同源双交换：则通过2个同源臂重组替换目标基因片段。 * 图1A：基于自杀质粒的同源重组 * 应用： 在大肠杆菌中，自杀质粒同源双交换可以用于敲除中等长度片段。在阿维链霉菌中，Komatsu等采用典型的自杀质粒同源双交换可一次性敲除1.48 Mbp 的基因片段。 自杀质粒同源重组敲除虽可广泛地应用于多种微生物，但反复构建质粒较为繁琐，并需要较好地控制条件以减少假阳性转化子。自杀质粒同源双交换中第二轮交换效率较低，且容易回复突变为野生型表型，不利于敲除突变株的筛选。 * 2.1.2 基于线性DNA 片段的同源重组 特点：线性DNA 片段是含有目的基因同源臂的敲除片段，通过电转化将敲除片段导入宿主菌中并与基因组发生同源重组，从而实现目的基因等位替换 (图1B)。 * 酿酒酵母中的应用： 线性DNA 片段的同源重组最早应用于酿酒酵母中，通过在筛选标记两端添加40~50 bp 的同源臂并PCR 扩增获得敲除片段，将其电转入酵母中发生同源重组，进一步利用抗性标记筛选敲除突变株在酿酒酵母和栗酒裂殖酵母中，通过线性DNA 片段同源重组已获得了一系列基因组精简菌株。 * 大肠杆菌中的应用： 但在大肠杆菌中，RecBCD 核酸外切酶会降解外源线性DNA片段，从而阻止敲除片段和基因组的同源重组。Datsenko 和Wanner 利用λ-Red 噬菌体中能抑制RecBCD 的酶Gam、核酸外切酶Exo 和单链结合蛋白Bet 构建辅助质粒pKD46，提高了外源线性片段DNA的重组效率和质粒同源重组效率。 线性片段同源重组在大肠杆菌的基因组精简中应用广泛，获得了许多基因组精简菌株，例如Δ16、Δ33、MGF-01 和DGF298。通过λ-Red同源重组可敲除较长的基因片段，两轮同源重组后获得无痕敲除突变株，最后将不影响底盘细胞特性的突变基因通过P1转导整合，获得最终基因组精简菌株。 * 枯草芽孢杆菌中的应用： 在枯草芽胞杆菌中，Morimoto 等结合线性DNA 同源重组和自杀质粒两轮同源重组进行基因组精简 (图1C)，前者用于敲除目的区域，后者用于去除筛选标记。线性敲除片段的构建较自杀质粒更为简捷，重组效率也较高。 * 图1C：同源重组和自杀质粒两轮同源重组进行基因组精简 * 引入负筛选标记提高无痕敲除突变株的筛选效率的方法： 在同源重组中，往往通过引入合适的负筛选标记，并利用负筛选标记表达菌株对特定物质具有敏感性的特点，提高无痕敲除突变株的筛选效率。常用的负筛选标记有SacB、RpsL、Upp、Ura3 或Ura4。特点如下： * 蔗糖