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分离提纯蛋白质有什么要求要求？ 纯度 决定于研究的目的和应用上的要求 活性 要求蛋白质保持天然构象状态，有高度的生物活性 收率 收率越高越好 提纯步骤愈多，则损失愈大 作为均一制剂，一般收率在5-20％，最高可以达到50％左右。 蛋白质分离提纯的准备工作 1、选材，处理； 2、建立适当的细胞破碎和蛋白质抽提方法； 3、建立一系列的分离提纯和浓缩的方法； 4、建立灵敏而方便的分析方法，以估计每一个分离提纯步骤的提纯倍数和收率； 5、建立鉴定纯度的方法(如：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦等)，以鉴定蛋白质制剂的纯度。 蛋白质纯化的基本设计原则 纯化条件尽量温和，避免蛋白失活。 低温(0℃-4℃)操作，防止热变性和蛋白水解酶水解。 严格控制pH值，防止过酸过碱对蛋白质的变性作用。 搅拌要缓慢，防止泡沫表面张力引起蛋白质变性。 防止蛋白质自发变性，可以采取下列措施： 加入低分子量物质(如蔗糖和甘油等)或加入纯化的蛋白质(如牛血清白蛋白BSA、明胶等)，以提高蛋白质浓度，减少水的伤害。 少数蛋白质必须在高离子强度的极性介质中才能保持活性，可以加KCI，或NaCl，(NH4)2SO4。 有的蛋白质需要加入二价金属离子(如Mg2+、Ca2+等)才能保持稳定性。 某些酶的提纯和保存，需要加入底物，才能稳定。 分离纯化的一般程序 三个阶段 前处理 选材，破碎，抽提，离心分离，得无细胞抽提液。胞外蛋白不须细胞破碎。 粗分级 根据不同蛋白质的溶解度、大小差异，对所需蛋白质进行初步的分离提纯。 细分级 根据不同蛋白质大小、带电量、疏水性、特异性等性质进行精细分级。 质量鉴定伴随全程 前处理——抽提 根据所需蛋白质溶解性，采用适当的溶剂抽提。 水溶性的清蛋白(如：血清白蛋白、卵清蛋白等)可以用水抽提； 不溶于水的盐溶性球蛋白(如：血红蛋白、肌红蛋白等)可以用稀中性盐溶液(如0.1MNaCl)抽提； 不溶于水和盐溶液但可溶于稀碱溶液的米谷蛋白和麦谷蛋白，可以用稀碱溶液抽提； 前处理——抽提 抽提就是将破碎细胞中的蛋白质溶解在适当的溶剂中。 不溶于水和中性盐溶液，但能溶于70～80％乙醇溶液中的醇溶蛋白(如醇溶谷蛋白)，可以用70～80％乙醇溶液抽提； 脂蛋白要用表面活性剂(即洗涤剂)才能抽提出来， 膜蛋白往往用非离子型表面活性剂的稀溶液抽提。 不溶性蛋白，如角蛋白、胶原、丝心蛋白，可以用适当的溶剂洗去可溶物。 前处理——抽提 使用类似于生理条件下的缓冲液 20～50mmol/L的磷酸缓冲液(pH7.0～7.5) 0.1mol/L Tris-HCI(pH7.5) 含少量缓冲液的0.1mol/LKCl 必要时，可加入EDTA(1～5mmol/L)，巯基乙醇(3-20mmol/L)或蛋白质稳定剂等。 2. 凝胶过滤层析法测定分子量 蛋白质在凝胶过滤层析柱中的洗脱体积Ve，与其分子量的关系如下式所示： lg Mr＝K1－K2 Ve 在实验中，只要测得几种蛋白质分子量标准物的Ve，并以它们的lg Mr对Ve作图得一直线，再测出样品的Ve，即可从图中得到样品的分子量。 SDS与凝胶过滤法是互补的 凝胶过滤法测得的是蛋白质四级结构（如果它有的话）的分子量； SDS测得的是蛋白质亚基的分子量； 在有2-巯基乙醇（或DTT）存在时，SDS可测得蛋白质每条多肽链的分子量。 综合应用这两种方法，可得到待测蛋白质结构的许多信息。 例如： 凝胶过滤法得到的蛋白质分子量：180kD SDS（不加还原剂）结果：45kD SDS（加还原剂）结果：两条蛋白带（15kD和30kD） 则结论是： 该蛋白质由4个相同的亚基组成，每个亚基由两条多肽链经二硫键连接而成，两条多肽链的分子量分别为15kD和30kD。 质谱法是最精确的分子量测定方法 质谱（ Mass Spectrometry，MS）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（m/z）的大小顺序排列的图谱。 由于ESI和MALDI两大电离技术的出现，质谱技术已广泛应用于蛋白质研究领域，包括蛋白质分子量测定。精确度0.01～0.1％。 5. 蛋白质免疫印迹技术 印迹法的基本原理 印迹（blotting）是生物大分子物质如核酸或蛋白质通过不同途径转移到固相载体上的过程。 与凝胶相比，固相载体容易和各种探针发生化学或免疫学反应。 转移后的固相载体经过试剂处理后，可与相应探针反应，然后用适当的溶液漂洗，置于含底物或探针的溶液中孵育，即可显示出谱带。 目前常用的印迹法有四种： Southern blot 检测DNA Northern blot 检测RNA Western blot 检测蛋白质 印迹法最常用的固体材料有硝酸纤维素（NC）膜和PVDF膜。 为减少