选择性脊神经后根切断刺激对大鼠脊髓腰膨大以及脑干网状结构抑制区和易化区c-Fos表达的影响.doc

选择性脊神经后根切断刺激对大鼠脊髓腰膨大以及脑干网状结构抑制区和易化区c-Fos表达的影响 ISSN1671—5926CN21—1470/R选择性脊神经后根切断刺激对大鼠脊髓腰膨大以及 40一.:Ogtlksinacom’’脑千网状结构抑制区和易化区c-Fos表达的影响 患者术前的斜视和流涎等症状也有不同程度的改善. 本实验通过选择性切断大鼠左侧腰3-6的脊神经后 根,观察Fos蛋白在脊髓腰3-6灰质后角和延髓,中 脑,脑桥网状结构的抑制区和易化区的表达来推断可 能存在的神经通路联系. 1材料和方法 设计:随机对照实验. 单位:郑州大学医学院人体解剖教研室. 材料:实验于2004—02/06在郑州大学人体解剖 学教研室完成.实验动物分组:成年Wistar大鼠64 只(体质量200-250g,雌雄不限),由河南省实验 动物中心提供,合格证号为410116.将大鼠在实验 环境中适应性饲养3d,随机分为脊神经后根切断组 (n=24),假手术组(n=24)和正常对照组(n=16). 再将3组分别分为损伤后1,2,6和12h组;后根切 断组和假手术组每小组各6只,正常对照组每小组 各4只. 设计,实施,评估者:实验设计为第一作者,由 第一,第二作者共同实施,由第三作者进行评估. 方法:模型制作:用质量浓度为10g/L的戊巴 比妥钠(广州化学试剂厂,3mL/kg)腹腔注射麻 醉.取背部正中切口,在xlO手术显微镜(上海医用 光学仪器厂,SXP-1手术显微镜)下咬除腰1,腰2 椎板,暴露脊髓,分离左侧腰3-6脊神经后根,并 切断2mm.假手术组只暴露脊髓,不进行脊神经后 根切断.术后缝合,放于术前同一动物房内饲养(室 温15-25oC,正常昼夜节律,充足的食物和饮水,无 强光,噪声刺激). 组织切片的制备:分别于1,2,6和12h相应的时 间点,将各组动物腹腔深度麻醉,常规进行心脏灌注. 先用生理盐水充分灌流后,用质量浓度为40g/L多聚 甲醛灌注固定.灌注结束后取动物脊髓的腰膨大和脑 干部,放人4质量浓度为40g/L多聚甲醛中后固 定12h.然后放人质量浓度为200g/L的蔗糖溶液 (0.01mol/L磷酸缓冲液配制)12h.将已经下沉的组 织取出,在冰冻切片机(LeicaE300)内做所需部位 连续冠状切片,切片厚25in,隔4张取1张,并 贴于已用多聚赖氨酸处理过的载玻片上.按Paxinos 和Watson图谱进行组织核团定位. 免疫组织化学法染色:用磷酸缓冲液洗3次, 3mi暾.滴加封闭用正常血清工作液,室温 15min.依次加人第一抗体(羊抗大鼠c-Fos, SantaCruz,1:100稀释),4湿盒孵育48h.(垒)磷酸 缓冲液洗3次,3min/次.加人生物素标记羊抗大 鼠免疫球蛋白IgG,4湿盒孵育12h.磷酸缓冲 液洗3次,3rain/次.加入辣根酶标记链霉卵白素 工作液,室温30min.(8)盐酸二氨基联苯胺显色:1mL 蒸馏水加盐酸二氨基联苯胺显色剂A,B,c各1滴, 镜下观察显色程度,显色5-20min,效果最佳时用 磷酸缓冲液终止显色反应.乙醇梯度脱水,二甲 苯透明后中性树脂封片.光镜下观察,细胞计数和 摄影. 细胞计数:光镜下c-Fos蛋白阳性表达是细胞核染 成深棕色,胞浆未染色,神经细胞无形态轮廓显示; 低倍和高倍镜下与背景区分明确.光镜下对各切片的 免疫阳性细胞进行计数.本实验中每只大鼠观察腰膨大 6张切片,分别计数左侧脊髓灰质板层I～内c—Fos蛋 白阳性表达细胞核的数量;观察网状结构抑制区和易化 区脑片6张,计数阳性标记细胞核数量.计算其算术 平均值. 主要观察指标:各组大鼠腰36脊髓灰质以及脑 干网状结构抑制区,易化区内c-Fos表达的量. 统计学分析:根据.3个实验分组,4个观察时 间,3个观察部位,利用Leica真彩图像分析技术进 行阳性细胞计数.统计出同一条件下1个部位内C- Fos蛋白阳性表达的.使用SPSS10.0对数据进行处 理,由第一作者进行统计学处理.以仅=0.05作为检 验水准.用t检验分析组间差异. 2结果 2.1实验动物数量分析脊神经后根切断组动物在 手术后有2只死亡,随即进行了补充,纳人最后分析的 动物为24只.假手术组动物24只,正常对照组动物 16只,没有死亡和丢失,全部进人最后的统计分析. 2.2腰膨大和脑干网状结构c-Fos的表达 2.2.1左侧腰髓3-6灰质板层I～c-Fos蛋白阳性 细胞表达核呈深黄色.主要集中在I-III板层,排列密 集.见图1. 脊神经后根切断组在l,2,6,12h均有明显表达; 假手术组在1,2,6h有少量表达;对照组在各个时间 点基本无表达.脊神经后根切断组与假手术组和对照 组在各个时间点比较均有显着性差异(Plt;0.05