饲料原料为底物植酸酶体外磷释放量的一种快速测定方法.docVIP

饲料原料为底物，植酸酶体外磷释放量的一种快速测定方法 目前，植酸酶作为饲料添加剂在饲料工业中 的应用已经非常广泛，不仅应用于猪和家禽饲料 中，而且在水产饲料中的应用也较为广泛。 在饲 料中添加植酸酶是一种提高动物利用饲料原料 中植酸磷能力的有效途径。 不论是 3-植酸酶（肌 醇六磷酸 3-磷酸水解酶）还是 6-植酸酶（肌醇六 磷酸 6-磷酸水解酶）， 都可以有效地从底物中释 放出磷。 通常情况下，植酸酶先按照设计比例添 加于动物日粮，再调整磷酸氢钙添加量。 因此，正 确评估植酸酶释放无机磷的能力具有十分重要 的意义。 目前， 国内有多种植酸酶活性测定方法，包 括国标（GB/T 18634-2002）和不同企业标准，但 均有一个共同特点：以植酸钠纯品（Sigma p-0109 或 p-8810）为底物评估酶活。下面着重介绍以饲 料原料为底物， 快速测定植酸酶体外释放磷的 方法。 1 材料与方法 1.1 试剂及仪器 参照 GB/T 18634-2002。 1.2 底物制备 将常用饲料原料底物如豆粕、玉米、菜籽粕、 棉粕和麸皮分别粉碎至大约 60 目， 按照饲料配 方中常用的比例配制两种不同比例 （表 1） 的配 方，将其混和，充分搅拌均匀。 表 1 底物饲料配方 原料 底物 1 底物 2 玉米 65% 62% 豆粕 20% 20% 棉粕 2% 6% 菜籽粕 1% 3% 麸皮 5% 4% 植酸磷含量 0.28% 0.22% 总重 930g 950g 1.3 酶样品来源 本试验采用的植酸酶产品来自两种不同 厂家的植酸酶产品。 酶 活 保 证 值 ：样 品 1 为 5 000 U/g；样品 2 为 10 000 U/g。 1.4 标准曲线制备 准确称取 0.680 4g 在 105℃烘至恒重的基准 磷酸二氢钾于 100mL 容量瓶中， 用乙酸缓冲液 （0.25mol/L，pH5.5） 溶解 ， 并定容至 100mL， 浓度 为 50.0mmol/L。 按表 2 的比例稀释成不同浓度， 按照表 3 进行操作。 标准空白为 4mL 乙酸缓冲溶 液（0.25mol/L，pH 5.5）与 8mL 终止液混合液。 以 无机磷浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，列出直 线回归方程（y=ax+b）。 表 2 标准溶液稀释倍数 序号 稀释量/mL 浓度/（mmol/L） 1 0.5→8 3.125 2 0.5→16 1.562 5 3 0.5→32 0.781 25 4 0.5→64 0.390 625 1.5 检测步骤与方法 准备试管按照表 3 的反应步骤进行操作。 首 先根据植酸酶产品在饲料产品中的添加量向每 支试管中加入饲料原料混合底物。 目前大多数植 酸酶活性大约为 5 000U/g 以及在饲料中的添加 量为 100mg/kg 左右， 即添加酶活量为 0.5U/g，则 实验中向每支试管添加 0.4g 饲料原料混合底物。 向每支试管中添加试剂的时间间隔必须一致， 37℃水解 1 h；试管在摇床中45°斜放。 表 3 反应步骤 反应顺序 样品/标准 样品空白 1. 每支试管称取 0.4g 饲料原料混合底物 √ √ 2. 待反应液在 37℃条件下预热 5min √ √ 3. 加入待反应液 4mL 4mL（第 2 步） 4. 混合 √ √ 5. 37℃摇床（250rpm）水解 1h √ √ 6. 加入终止液 8mL 8mL（第 1 步） 7. 充分混匀 √ √ 注：样品空白在第一步加中止液以终止其反应。 反应后在室温下静置 20min，然后离心（4 000 r/min）10min， 上清液以标准曲线的空白调零，在 分光光度计 415nm 波长处测定样品空白 （A 0 ）和 样品溶液（A）的吸光值，A-A 0 为实测吸光值。 用 直线回归方程计算植酸酶的活性。 1.6 重复性与检出限检验 采用一种未知植酸酶产品和表 1 中的底物 2 按照表 3 的测定步骤，每日做 6 个重复，连续进 行 3d 测定本方法的重复性。 根据目前植酸酶在 饲料中的推荐剂量， 在测定检出限试验中设定 50、80 和 100g/t 3 个添加量， 并按照表 3 的步骤 进行实验。 1.7 实例分析 随即选取 6 种饲用植酸酶产品， 并编号 1，2，3，4，5 和 6， 然后按照表 3 中的试验步骤测 定植酸酶产品从混合饲料原料底物中释放的无 机磷量。 1.8 统计方法 采用 EXCEL 表格统计 RSD 值， 以及 SPSS 16.0 单因素方差分析 ， 利用 Ducan 进行多重比 较，P0.0.5 时为差异显著。 1.9 计算和表示 每克植酸酶释放无机磷的量为： P = C/m×F×31/1 000 式中：P———植酸酶从饲料原料混合底物中 释放的无机磷量，mg/g； C———根据