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细胞生物学技术 吕冬霞 基础医学院生物学教研室 2011年10月 2011诺贝尔生理学或医学奖！？ 传统意义上，疫苗的作用，在于预防。而以3人所获研究成果为基础，新型疫苗着眼于以新颖手段治疗癌症，获称“治疗性疫苗”，旨在调动人体免疫系统对肿瘤发起“攻击”。另外，他们的成果有助于治疗一些炎症类疾病，如风湿性关节炎。 细胞是生物体的结构和功能单位。 一切生命的关键问题都要在细胞里面寻找(1925, Wilson)。 第五章 细胞生命现象的研究技术 一、细胞增殖生长力 （一）细胞计数——细胞生长曲线的绘制 意义：了解培养细胞增殖详细过程和 细胞生长基本规律 细胞生长曲线绘制----实验范例 实验用品 　▲材料 贴壁培养的细胞。 ▲器材 24孔培养板、吸管、胶帽、离心管、 培养皿、半对数坐标纸、盖玻片、细胞计数板、 酒精棉球、酒精灯、离心机、倒置显微镜、普通 光学显微镜、超净工作台、CO2培养箱。 ▲ 试剂 Hanks液、DMEM培养基 (含10%小牛血清)、0.25%胰蛋白酶消化液、吉姆萨染液。 实验步骤 1、在进行生长曲线测定时，接种到培养板孔中 的细胞数量应保持每孔一致 （2×104~5×l04个/ml） 。 2、接种量应适当，不能过少或过多，过少将使 细胞生长周期延长，过多将导致细胞在实验 未完成前即需传代，这两种情况下所得到的 生长曲线均不能较准确地反应细胞的生长状 况。 不足：活细胞和死细胞同时被计数，误差较大。 （二）细胞分裂指数（mitotic index ,MI）： Phases of the Cell cycle 实验步骤 ?? P130改错： （1） （2） （3） （4） （5）按2×104~5×104/ml的密度将细胞接种于置有盖玻片的培养皿中。 （5）每24h取出1张盖玻片，经95%乙醇固定5min.。 （6）用吉姆萨染液对盖玻片的细胞染色10min。 （7）高倍镜下观察细胞结构，对分裂期细胞及非分裂期细胞加以识别。 （8） 选出细胞密度高、中、低3个不同的区域，每一区域观察1000个细胞，统计并记录其中的分裂细胞数。 （9） 计算上述3个区域的分裂细胞数平均值。 （10）求出分裂细胞在1000个细胞中所占的比例，即可得培养细胞在不同时相点的分裂指数。 （11） 以各时相点为横坐标，各时相点时细胞的分裂指数为纵坐标，绘制培养细胞分裂指数曲线。 细胞分裂指数曲线 细胞分裂指数注意事项 掌握好确定分裂相标准，其中主要是确定好划分间期和前期、末期和间期等的界限，当两人以上进行观察时更须如此，并始终一致，否则会发生人为误差。 细胞分裂指数曲线与生长曲线趋势基本一致，但不完全相同，如当细胞增长达饱合密度并进入停止期后，细胞数值很大，而分裂相可完全消失。 操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。 （三）细胞集落形成实验 意义：检验活细胞的增殖能力，避免了在生长曲线绘制时将死细胞或不能分裂细胞计数在内而导致的实验结果误差。 原理：单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代形成一个细胞群体，称为集落或克隆。每个克隆均包含50个细胞以上，大小在0.3~1.0mm之间。通过计算克隆形成率，来测定测试细胞的增殖能力。 影响集落形成率的因素： 培养液 血清质量、浓度 温度 酸碱度 细胞密度 一般情况下： 初代培养细胞集落形成率低，传代细胞较高； 正常细胞较低，转化细胞较高。 应用： 干细胞研究 肿瘤研究： 肿瘤是由不同增殖及分化能力的瘤细胞群构成，其中仅有部分具有自我更新能力，即肿瘤干细胞。 目前认为，只有肿瘤干细胞具有形成集落的能力。 细胞集落形成实验可以作为抗肿瘤药物或致癌物质检测的有效手段。 实验用品：（平板克隆形成实验） 材料：HeLa细胞 试剂：1640培养液、胎牛血清、0.25%胰蛋白 酶、吉姆萨染液。 设备：细胞计数板、60mm培养皿、10ml移 液管、小烧杯、10ml吸管橡皮头、超净 工作台、培养箱、倒置显微镜、离心机、 水浴锅。 实验步骤： （四）3H-TdR渗入法（氚标记胸腺嘧啶核苷） 3H-TdR渗入法 实验用品 材料 贴壁培养的细胞 器材 液闪计数器（液体闪烁计数器 ）。 试剂 标记物 5μCi[methyl-3H]-TdR/