免疫球蛋白的基本结构抗原决定簇.pptVIP

《生物工程总论》之 “细 胞 工 程” 篇 讲授内容及学时分配表 第十一章 动物细胞融合与杂交瘤技术 一、动物细胞融合技术 二、杂交瘤技术与单克隆抗体的生产 一、动物细胞融合技术 Muller于1838年观察到脊椎动物的肿瘤细胞体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 一、动物细胞融合技术 Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。 1958年日本学者冈田（Okada）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。 一、动物细胞融合技术 1、病毒诱导融合法（生物法） 是副粘病毒科的一些病毒，如仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒，其中仙台病毒最常用。 1962年，日本的冈田善雄(Okada) 发现日本血凝性病毒(HVJ)也叫仙台病毒，引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象． 1965年英国的Harris和Watkins在利用灭活病毒诱导细胞融合方面做了大量的工作，并进一步利用这种灭活病毒来诱导不同种动物细胞间的融合。 仙台病毒诱导融合机理是： 病毒囊膜上的刺突（具凝血活性何唾液酸苷酶活性）与细胞膜上糖蛋白起作用，使细胞发生凝聚，使膜上的蛋白质使脂类分子重排，打开质膜，导致细胞融合。 病毒诱导融合法的特点： 优点：对各种动物细胞都适宜；病毒繁殖量大，易培养。 缺点：制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大、实验的重复性差、融合率很低，另外病毒可能会对细胞的生命活动产生干扰等。 目前，这种方法主要适用于动物细胞融合，用于实验室研究。 2、聚乙二醇诱导融合? 　　继高国楠(Kao) 用PEG成功诱导植物原生质体融合后，1975年，Potecrvo用该法成功融合动物细胞。该法以其特有的优势迅速取代病毒诱导动物细胞融合。 3、电诱导融合 同植物原生质体融合 二、杂交瘤技术与单克隆抗体的生产 （一）何谓单克隆抗体？（monoclonal antibody,McAb） 抗体（Antibody,Ab）：是指能和相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 抗原(Antigen，Ag)：能启动机体的免疫应答，且能与其免疫应答产物(抗体或免疫效应细胞)特异性结合，并发生一系列生物学效应的物质。 免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）:是指具有抗体活性的或化学结构与抗体相似的球蛋白。 抗体和免疫球蛋白的关系：抗体是免疫球蛋白，并非所有的免疫球蛋白都具有抗体活性。 （抗体结构图） 只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。 抗原决定簇：存在于抗原分子表面（有的在内部），决定该抗原特异性的特殊化学基团。 抗原以抗原决定簇与相应淋巴细胞的抗原受体结合而激活淋巴细胞引起免疫应答； 抗原与相应抗体的特异性结合也通过抗原决定簇来完成 。 每一个抗原决定簇，其性质和空间构型决定着一种特异性，可与一种抗体结合。一个抗原分子可以有一种或多种不同的抗原决定簇 单克隆抗体（McAb）的应用： 主要用于疾病的诊断、治疗和预防。 如各种癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫等数百种疾病的诊断。 在疾病治疗方面，单克隆抗体犹如人体卫士，能识别“自己”与“异己”，一旦发现致病因素便与之结合将其杀死。若在单抗上带上抗癌药物制成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞又不会伤害健康细胞。 与常规抗体相比，具有特异性强、灵敏度高的优点。 3、骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 骨髓瘤细胞株在融合前应先用含8-氮鸟嘌呤的培养基作适应培养， 因为HGPRT—有返祖现象。次日一般即为对数生长期细胞。 体外培养条件下，细胞的生长依赖适当的细胞密度，因而，在培养融合细胞或细胞克隆化培养时，还需加入其它饲养细胞在。常用的饲养细胞为小鼠的腹腔细胞。 6、克隆筛选阳性杂交瘤细胞 用HAT培养基筛选：氨基喋呤(A)可以阻断DNA的从头合成途径，HGRPT－（未融合的及自身融合的骨髓瘤）不能利用H和T而合成DNA，而导致死亡。脾细胞由于不能无限增殖最终死亡。唯有杂交瘤细胞可由HGRPT酶经过旁路途径利用H，T合成DNA，能无限增殖而存活。 7、单克隆抗体检测 融合细胞呈克隆生长，经有限稀