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人视网膜血管内皮细胞分离与培养 　　[摘要] 目的：探讨人视网膜血管内皮细胞的体外分离和选择性培养方法。方法：将人视网膜通过剪碎、匀浆、过筛、胶原酶消化处理后，结合密度梯度离心和物理刮除等分离方法获得较纯的视网膜血管内皮细胞，接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中，并采用含内皮细胞生长因子和肝素的培养基促进内皮细胞贴壁生长，观察细胞生长状况，并应用免疫组化方法进行鉴定。结果：培养的细胞成典型的铺路石样生长，Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色为阳性，细胞纯度达98%以上。结论：本实验方法简单易行，培养出的人视网膜血管内皮细胞纯度高、生长状态良好，并可稳定传代，为视网膜血管疾病的基础研究提供有效的模型建立方法。 　　[关键词] 视网膜 微血管 内皮细胞 细胞培养 　　 　　许多视网膜疾病如糖尿病性视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等均与视网膜血管病理性改变密切相关。随着对视网膜血管性疾病的研究深入发现视网膜血管内皮细胞是血管病变过程中的关键细胞。通过体外分离培养视网膜血管内皮细胞获得大量完整、纯度高的内皮细胞，从而对其进行形态、结构、生理功能和病理变化等方面的观察，为视网膜血管性疾病研究提供体外模型。本实验综合国内外几种方法，以人视网膜为材料，探索简便、有效的人视网膜微血管内皮细胞的培养方法。现报告如下： 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 材料 　　0.1%Ⅱ型胶原酶（Sigma公司，美国）、胎牛血清(Gibco公司，美国) 、DMEM培养液(Gibco公司，美国)、含0.02%EDTA的0.25%胰酶(Gibco公司，美国)、纤维连接蛋白（Sigma公司，美国）、内皮细胞生长因子ECGF(Sigma公司，美国) 、Percoll分离液（Gibco公司，美国）、肝素（Sigma公司，美国）、PBS（Sigma公司，美国）、培养瓶、培养皿、眼科器械、匀浆器、吸管、离心管、细胞筛、第Ⅷ因子相关抗原抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)，完全培养液：DMEM培养液+15%FBS+90ug/ml肝素+0.1ug/L的ECGF，培养瓶：培养前1天用10ug/cm2纤维连接蛋白包被。 　　1.2 方法 　　1.2.1 人视网膜微血管内皮细胞的分离与原代培养 　　原代细胞培养使用的眼球为角膜移植后残留的供体眼球。无菌操作，浸入酒精中消毒2遍，转入DMEM培养液中。距角膜缘后3mm穿刺，剪去眼前节，娩出玻璃体，吸取DMEM培养液将视网膜神经层吹起吸出，将视网膜置于DMEM培养液中洗涤2-3次，去除色素组织并夹出较大的血管，再将视网膜转入另一培养皿中剪碎后匀浆，将匀浆液过两层细胞标准筛（先过220um，后过86um），将第2层细胞筛翻转后用DMEM培养液充分冲洗，收集洗脱液后离心（1000r/min，10min），弃上清后加入3倍体积的0.1%胶原酶吹打均匀后移入离心管中在37℃200r/min摇床上消化60min，离心（1000r/min，10min），弃上清，用DMEM培养液悬浮细胞，将Percoll分离液加入DMEM培养液中，以20000r/min离心30min制备连续密度梯度，吸取上述细胞悬液2ml小心加入25ml离心管顶层分离介质面上，离心（1000r/min，10min），用注射器针头吸取所需的细胞层(第2层)，以添加ECGF的完全培养液悬浮细胞，接种于包被有10ug/cm2纤维连接蛋白的培养瓶内，将培养瓶置于5%CO2、37℃培养箱内培养细胞。24 h内严禁移动培养瓶。培养2d后首次换液，以后每2d换液1次，保持ECGF的浓度。换液前相差倒置显微镜下观察视网膜血管内皮细胞，标记杂细胞位置，用细胞刮去除杂细胞。 　　1.2.2 人视网膜微血管内皮细胞的传代培养 　　当原代细胞融合80％以上后，开始传代培养。吸去培养液，用PBS清洗1～2次；加入0.25%胰蛋白酶与0.02 EDTA混合消化液，室温下消化，在相差显微镜下观察，当铺路石样细胞开始变圆收缩，细胞间隙变大时，倒出消化液；以含15%FBS的完全培养液终止消化，反复吹打瓶壁上细胞，脱壁后形成细胞悬液，按1：2的比例进行传代，接种于纤维连接蛋白包被的培养瓶中。传代后每2～3 d换液1次。 　　1.2.3 人视网膜微血管内皮细胞的鉴定 　　(1)形态学：在相差倒置显微镜下观察视网膜血管内皮细胞形态特征、生长特性及与微血管碎片的距离，并运用目镜网格器计数法观察记录培养瓶中混杂的其他细胞，每瓶选择3个视野，实验各重复3次。(2)Ⅷ因子相关抗原免疫组化检查：以0.5×105/L的细胞密度接种2mL细胞悬液接种于预先置有20mm×20mm盖玻片的六孔板中，并置于37℃的培养箱中培养24h至细胞爬满玻片后取出，PBS漂洗细胞2次，以4%多聚甲醛固定20min；PBS冲洗3