ch9外源基因的表达.pptVIP

在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白分子。 2. 包涵体蛋白表达载体 Trp的-35区+LacUV5的-10区和操作子和S-D序列 终止子 在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或分泌方式定位于细胞周质，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物N端信号肽序列的存在是蛋白质分泌的前提条件。 3. 分泌型蛋白表达载体 包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中，这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白，它激活定位于内内上的磷酸酯酶，导致细菌内外膜的通透性增大。 因此，只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌。 脂蛋白基因启动子+Lac UV5启动子 外膜蛋白基因 4. 寡聚型异源蛋白的表达 从理论上讲，外源基因的表达水平与受体细胞中可转录基因的拷贝数（即基因剂量）呈正相关。然而重组质粒除了含有外源基因外，还携带其它的可转录基因，如作为筛选标记的抗生素抗性基因等。随着重组质粒拷贝数的不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用于合成所有的重组质粒编码蛋白，而细胞的正常生长代谢却因能量不济受到影响，因此通过增加质粒拷贝数提高外源基因表达产物的产量往往不能获得满意的效果。 另一种通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量的有效方法是构建寡聚串联型异源蛋白表达载体，即将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略 第二节 提高外源基因在大肠杆菌中表达效率 (1) 以融合蛋白表达目的蛋白提高融合蛋白的稳定性相产量。 (2)使用强启动子提高mRNA产量，并在基因下游加入稳定mRNA的强转录终止子，防止转录过度。 (3) 调整SD序列与ATG间的距离。SD序列与ATG的距离过长或过短都会影响目的基因 的表达，有时由于这种距离的影响蛋白质合成会相差2000倍以上。应该在目的基因ATG下游 100bp左右开始，用酶切形成不同长度的片段，与带启动子和SD序列的载体连接后，产生一系 列重组DNA。从中选择产生高水平天然目的蛋白的重组体。 (4) 利用蛋白酶缺陷型的宿主，例如用lon营养缺陷型减少外源蛋白的降解。 (5) 在宿主内表达蛋白酶抑制产物，从而抑制蛋白酶的活性。例如将T4噬茵体的pin基因克隆和转化到E. coli中，抑制蛋白酶活性。 (6) 使蛋白质分泌到体外，减少反馈抑制或蛋白酶降解。 (7) 调整带目的基因的表达质粒的拷贝数，增加模板数。例如使用pKN402载体 拷贝数与温度有关，故改变温度可增加目的基因的拷贝数。 (8) 利用诱导物进行表达。过早地大量表达外源基因往往影响宿主细胞的繁殖，因此当不 表达时，可使宿主细胞迅速繁殖生长得到较大的生物量，然后利用诱导物诱导目的基因表达。 (9)人工合成目的基因，在不改变蛋白质氨基酸的前提下，根据简并性，利用宿主偏爱的密码子改变部分碱基序列， (10) 定点诱变，消除核糖体结合位点附近可能的二级结构，这种二级结构会影响翻译起始 效率。 (1) Northern杂交。检查细胞中是否含有恃定的mRNA，测定特定mRNA在总RNA中的 比例，由此获得日的mRNA的转录情况。 (2) 斑点杂交。用特异性探针检查mRNA，并估计表达过程中mRNA的转录强度。 (3) SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，分析诱导前后细胞中目的蛋白质的表达水平。如表达水平 很低，也可用同位素，如35S甲硫氨酸或35S半肮氨酸进行代谢标记，然后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影，或在Western杂交中用待异性抗体分析目的蛋白质的存在及其含量。 第三节 表达产物的检测 (4) 免疫学方法。利用特异性抗体与目的蛋白进行反应，经免疫沉淀、ELISA等免疫学方法，检测基因表达的强度。 (5) 直接测定目的蛋白的生物活性，根据生物活性的大小估