白介素的表达.pptVIP

白介素的表达与生产 白细胞介素-2（IL-2）是由激活的辅助性 T 细胞产生的一种重要免疫调节因子，是负责 T淋巴细胞由细胞周期 G1期向 S 期过渡的重要细胞因子。在体外它能长时间地维持 T淋巴细胞的生长，在体内它能促进 T、B 细胞及自然杀伤细胞（NK 细胞）的增殖与分化，刺激活化 T细胞分泌 IFN-γ、CSF 等细胞因子的产生，增强 Tc、NK、MΦ细胞毒活性，诱导肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）及淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）的产生，因而 IL-2 在治疗肿瘤、免疫缺陷性疾病、肝炎、麻风等疾病中有重要作用。另外，IL-2 具有重要的中枢调控作用，能够影响神经元和神经胶质细胞的存活和生长，具有中枢镇痛功能。 目前，利用重组 DNA 技术，已在大肠杆菌、酵母、猴 COS 细胞和昆虫细胞等中获得表达有生物活性的 r hIL-2。人 ＩＬ-２ 前体由 １５３ 个氨基酸残基组成，在分泌出细胞时，其信号肽（含 ２０个氨基酸残基）被切除，产生了成熟的 ＩＬ-２，其相对分子量为 １５４２０，它是一种糖蛋白。人 ＩＬ-２ 基因只有一个拷贝，定位于第 ４ 号染色体长臂的 ２６-２８ 区。ＩＬ-２ 基因大约有 ４９３０　ｂｐ，由 ４ 个外显子和 ３ 个内含子组成 ＩＬ-２的表达 基本流程 目的基因的获得 构建 DNA 重组体 将 DNA重组体转入宿主菌构建工程菌 工程菌的发酵 外源基因表达产物的分离纯化 产品的检验 目的基因的获得 从细胞核中直接分离 　 染色体DNA的限制性内切酶酶解 人工体外合成 　 用逆转录酶制备cDNA 对目的基因要进行限制性内切酶和核苷酸序列分析以保证获得的目的基因是正确的。 2.受体菌和表达载体的选择 目的基因获得后，最重要的是要使目的基因表达。基因的表达系统有原核生物表达系统和真核生物表达系统。选择基因表达系统主要考虑的是保证表达蛋白质的功能，其次要考虑的是表达量的多少和分离纯化的难易。将目的基因与表达载体重组，转入合适的表达系统，获得稳定高效表达的基因工程菌。 2.1 受体菌的选择 基因工程方法生产 IL-2 大多是以大肠杆菌为工程菌。由于内毒素的存在，给纯化和人体内应用(如治疗肿瘤)带来困难，而且大肠杆菌缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化，形成二硫键等。有关 IL-2 重组的研究很多。对于不同系统的研究使人们对 IL-2 的重组积累了大量的经验。但是，从开发的角度看，所有这些系统都或多或少的存在一些问题，要么表达量低，要么成本高，不适合工业化生产。 毕赤酵母 (Pichia Pastoris)表达系统, 由于酵母菌是低等真核类生物, 没有大肠杆菌细胞壁内毒素的污染, 除此之外它还具有许多优点： ① 含特有的 AOX(醇氧化酶基因)启动子，用甲醇可以严格地调控表达； ② 有完备的发酵方法,可以高密度连续培养，蛋白产量高； ③ 生存能力强，易于处理，可以在廉价的非选择性培养中生长，补充盐，维生素即可； ④ 基因表达产物既可在胞内积聚，又可被分泌，分泌的异源蛋白质占所有被分泌蛋白的 30%以上，利于工业规模的下游分离加工。因此，这是一种非常先进的表达系统。 　 巴斯德毕赤酵母表达菌株有胞内积聚型与分泌型。由于胞内重组蛋白质分离纯化工作量大，而分泌的表达物易于下游纯化及工业化生产，一般常被选用。分泌型 Pichia pastoris 主要有两种表达菌株 GS115 与 KM71。两者都是 His 缺陷型（组氨酸缺陷型），可初步用于筛选转化子。（组氨酸脱氢酶基因发生突变，阻止它们合成组氨酸。如果表达载体上携带有组氨酸基因，可补偿宿主的组氨酸缺陷，因此可以在不含组氨酸的培养基上筛选转化子） 2.2 表达载体的选择 由于巴斯德毕赤酵母没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型质粒作为外源基因的表达载体。常见的表达载体有 pPIC3K，pPIC9K，pHIL-D1，pAO804，pAO815，pPSC3K 等。一般情况下，整合到酵母染色体上的基因拷贝数越多，则蛋白表达量越大.鉴于把提高整合的拷贝数作为提高外源基因产量的重要手段，我们选择了快速筛选高拷贝整合转化子的载体 pPIC9K。 6 载体 pPIC9K含有来自转座子 Tn903 的 Kan