第7讲重组子的构成、导入.pptVIP

重组子的构成、导入和筛选 第一节 基因克隆的载体 载体的条件 能自主复制 具备筛选标记 适当分子量和内切酶切点 在细胞中的拷贝数高 载体的分类（来源） 质粒载体 噬菌体载体 动物病毒载体 酵母质粒载体 载体功能分类： 克隆载体和表达载体 筛选标记 筛选细菌中是否带有质粒的标志 抗生素抗性基因 LacZ基因 某些特殊酶基因 多克隆位点（multiple cloning site） 是一段人工合成的DNA序列，含有密集排列的多种限制性酶切位点，以利于不同来源的外源DNA片段插入载体。 启动子 转录插入外源基因 T7 、T3、SP6等 质粒 概念：是细菌染色体之外的小型双链环状DNA。 与细菌的关系：严紧型和松弛型 在一个细菌细胞内数量： 低拷贝1-5个 中等拷贝10-100 高拷贝200-1000 质粒分子量：3K--100K 质粒载体的主要作用 保存和扩增目的基因DNA（10Kb以下） 构件cDNA文库 目的基因测序 核酸杂交探针的来源 原核表达等 噬菌体载体 概念：感染细菌的病毒 插入载体：外源DNA直接插入噬菌体，容量小，10Kb以下。 替代载体：噬菌体基因组中非必需基因被外源DNA替代，容量10-20Kb。 粘粒质粒（cosmid） 由质粒和噬菌体的cos粘性末端构建而成。容量大（45Kb）可用于基因组文库构建。 动物病毒载体 目的：向真核细胞中运载目的基因。 常用的病毒载体 杆状病毒载体（pVL、pAC系列）主要用昆虫细胞表达。 SV40 （pCAT 系列）哺乳类动物细胞表达 痘苗病毒载体 逆转录病毒载体：转基因效率高；宿主广泛；整合效率高。（优劣参半） 酵母质粒载体 特点：既可在大肠杆菌中复制又可以在酵母菌系统中复制。（穿梭载体） 主要用于大分子量基因组生物基因组文库文库构建。 目的基因与载体的连接 连接策略 粘末端连接 5‘ ---------G AATTC---------3’ 3’ ---------CTTAA G---------5’ 注意同尾酶 目的基因与载体的连接 连接策略 2 定向连接 DNA两端为非同源互补的粘性莫端（双粘） DNA两端，一端为粘端，一端为平端。 效率问题：双粘高效 平末端连接 低效率、串珠问题 目的基因与载体的连接 连接策略 4 人工接头连接 连接子 普适子 T-A克隆 目的基因与载体的连接 连接反应体系 10Xbuffer T4连接酶 载体DNA 目的DNA 注意：1。温度 4度，16度 ，25度 2。 时间：过夜，30min，1h 3。 载体 DNA量：50-100ng 4。 载体与目的DNA比例 1：5（摩尔比） 5。 酶量：WEISS单位和其他单位 6。 PEG和BSA 添加问题 重组子导入受体菌 氯化钙法（经典） 电穿孔法 效率高，注意温度，电压等因素。 重组子的筛选与鉴定 酶切鉴定（经典） PCR方法鉴定 核酸杂交 注意：单酶切点插入目的DNA的方向 酶切顺反方向鉴定 * * LacZ基因筛选标记