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硕士研究生论文答辩 安徽省立医院急诊医学 2011年5月 不同高压氧预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的研究 答辩人：朱春艳 导 师： 刘 宝 教授 不同高压氧预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤的研究 研究背景:肾脏缺血再灌注损伤是急性肾衰竭发病的重要原因之一，在临床上常见于失血性休克、肾脏移植、腹主动脉和肾动脉手术、部分肾脏切除、肾实质切开取石[1]等。其发病机制复杂，迄今仍未完全阐明，有研究表明与肾血流动力学异常、肾小管上皮细胞代谢障碍、肾小管上皮脱落、管腔中管型形成、再灌注氧自由基生成、炎症细胞浸润和细胞因子异常等有关[2]。高压氧有提高机体耐低氧能力、清除氧自由基、抑制炎症反应和细胞凋亡、改善微循环等作用[5,6,7,8]。本研究观察大鼠缺血再灌注后血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA），肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin- 6，IL- 6）的变化，研究不同时间高压氧预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤的影响并探讨其可能机制 * * 1.材料与方法 实验动物：雌性清洁级SD大鼠50只（安徽医科大学实验动物中心提供），体重200～250g，饲养环境维持12h昼夜节律，自由取食及饮水，手术前12h禁食。 实验方法：1.2.1 实验分组 将大鼠随机分为假手术组（S组，n=10）；缺血再灌注组（IR组，n=10）；高压氧预处理1组（H1，n=10）：连续4天高压氧预处理； 高压氧预处理2组（H2，n=10）：连续8天高压氧预处理；高压氧预处理3组（H3，n=10）：连续16天高压氧预处理。假手术组仅打开腹腔找到双侧肾蒂，20min后关闭腹腔，缺血再灌注组和高压氧预处理组均进行肾脏缺血再灌注损伤造模。 1.2.2高压氧预处理 实验分组后，S组及IR组不行高压氧干预。高压氧预处理组分组后行高压氧治疗，1次/d，H1组高压氧预处理4次，H2组预处理8次，H3组预处理16次。高压氧处理采用空气加压舱，预处理时将大鼠置于密闭消毒后容器中，容器内加入适量无菌注射用水并湿润大鼠毛发，防止静电发生。容器的进氧管接舱内的直流式供氧口，排气管接舱内的排气口，20min缓慢加压到0.25MPA，100% O2维持1h，减压20min，共100 min；末次高压氧预处理后24h，建立肾脏缺血再灌注损伤模型。 1.2.3 建立大鼠肾脏缺血再灌注损伤模型 (图1) 大鼠称重后，按每100g给予水合氯醛0.3ml腹腔注射麻醉。顿性分离肾蒂，分离出输尿管后，用无创伤血管夹夹闭右肾动静脉，同法夹闭左肾动静脉，开始计时，并观察肾脏颜色，由红润变为苍白表示夹闭有效，30min后移除双侧血管夹，再观察肾脏颜色由苍白转为红润表示再灌注成功。若松开血管夹5min，肾脏未转变为正常的红色，认为再灌注失败。逐层关闭腹膜、腹白线、皮肤，以0号线打结，用75%酒精消毒伤口后放回笼中继续饲养 肾脏颜色苍白 夹闭双侧肾蒂30min 1.2.4 标本采集及实验 缺血再灌注损伤24h后处死大鼠，由下腔静脉采血5-6ml，3500r/min离心5min取上层血清保存于-80℃冰箱中备用（用于测定血Cr、BUN、TNF-α和IL- 6）。取左肾腹面下半个肾组织，于10％中性缓冲福尔马林溶液中固定交由病理科人员，常规脱水、透明、石蜡包埋，置入冰箱中保存备用。切片，HE染色待用。 1.2.5 在生化实验室行血Cr、BUN测定。酶联免疫吸附实验（ELISA）法测定血液中TNF-α、IL- 6水平，严格按照试剂盒的说明书步骤进行。 1.3统计学分析 数据采用SPPSS13.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用±S表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，以P0.05有统计学意义。 结果 2.1肾组织形态学观察S组为正常肾组织；IR组肾脏外形肿大，皮质肿胀，颜色发白，髓质呈暗红色；H1、H2组肾脏外观接近于假手术组，H3组更接近于缺血再灌注组。HE染色S组肾小球、肾小管结构正常；IR组肾小球萎缩，肾小管上皮细胞有不同程度坏死，间质明显水肿，大量炎症细胞浸润，毛细血管通透性增高，有红细胞溢出； H1轻度肾小球萎缩，H2仅有肾小管上皮肿胀，H3组有炎症细胞浸润，肾小管透明变性。 S组 IR组 H1组 H2组 H3组 2.2 大鼠肾脏功能检测 IR组Cr、BUN明显高于S组（P0.05）, H1、H2、H3组与IR组相比，BUN、Cr明显下降（P0.05） 72.17±6.16b 7.49±0.49b 10 H3 81.50±3.97b 10.62±0.38b 10 H2 85.13±7.98b 11.47±0.62b 10 H1 1