中国甜柿自然脱涩相关基因adh和pdc的分离及功能验证-果树学专业论文.docx

华中农业大学学位论文独仓lj性声明及使用授权书鼎学位论文是否保密易如需保密，解密时间年月疆独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育规^构的学位或证书 褥使用过的材粹，指导教师对此进行了审定．与我一弼工作的同志对本研究所锨的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意．研究生签各羔蕃动磅闭：知旷年／歹月名丑学位论文使用授权书㈨嫦槲影移撇玺嘶签名日期：知}箩年，瑚如签名日期：跏f r jf良月l≤日万方数据中国甜柿自然脱涩相关基因ADH和PDC的分离及功能验证目录摘要．．iAbstract．iii缩略语表Vi1课题提出和前人研究进展。11．1课题的提出11．2前人研究进展31．2．1柿单宁的分类31．2．2柿单宁组成成分和结构31．2．3柿单宁功能。61．2．4柿单宁生物合成71．2．5柿果实脱涩机理．．1 11．2．6植物遗传转化．．131．2．6．1稳定遗传转化法131．2．6．2瞬时转化法1 51．3研究目的和研究内容．．191．3．1研究目的。191．3．2研究内容191．3．2．1柿瞬时转化体系的建立191．3．2．2柿单宁凝固基因ADH和PDC的表达分析及功能验证192柿瞬时转化体系的建立202．1前言．202．2材料和方法．212．2．1试验材料。212．2．2总RNA提取212．2．3 cDNA合J或．212．2．4 qRT-PCR表达分析．．222，2．5植物载体构建232．2。6农杆菌侵染菌液的制备及渗透侵染．．252．2．7瞬时转化条件优化262．2．8 GFP荧光观察和蛋白含量测定。262．2．9 GUS染色272．2．10叶片单宁含量测定272．3结果与分析．28万方数据华中农业大学2015届博士研究生学位(毕业)论文2．3．1农杆菌注射渗透介导的柿活体叶片瞬时超表达体系的建立282．3．1．1叶片觎P瞬时表达．．282．3．1．2活体叶片瞬时转化体系的优化．282．3．1．3叶片DkLACl瞬时超表达功能验证302．3．2农杆菌注射渗透介导的柿活体叶片瞬时沉默体系的建立332．3．2．1叶片DkPDS瞬时沉默表达量分析．．332．3．2．2叶片DkLAR基因瞬时沉默功能分析．．342．3。3农杆菌真空渗透介导的柿组培苗瞬时转化体系的建立372．3．3．1离体叶片GUS和GFP瞬时表达372．3．3．2不同真空渗透时间对瞬时转化效率的影响382．3．3．3柿组培苗DkLAR瞬时沉默功能验证382．4讨论．．402．4．1柿瞬时转化体系的建立402．4．2 D删R基因参与原花青素的累积。422．4．3删CJ『基因参与原花青素的聚合433柿单宁凝固基因ADH和肋C表达分析及功能验证．443．1前言．．443．2材料与方法。453．2．1试验材料453．2．2单宁含量的测定453．2．3总RNA提取．453．2．4 eDNA合成．463．2．5 ADH和PDC基因的克隆473．2．6 qRT-PCR表达分析．．483．2．7乙醇和乙醛含量测定483．2．8表达载体构建及柿叶片瞬时转化483．3结果与分析．．493．3．1柿果实发育过程单宁含量变化493．3．2 ADH和肋C基因的分离503．3．3 ADH和PDC家族成员基因时空表达模式分析513．3．4乙醇和乙醛含量分析553．3．5 DkADH和D灯IDC同源瞬时表达功能验证．．563．4讨论．．!；73．4．1 CPCNA自然脱涩特点．57万方数据中国甜柿自然脱涩相关基因ADH和PDC的分离及功能验证3．4．2 ADH和PDC参与CPCNA自然脱涩过程583．4-3种子在CPCNA自然脱涩中的作用594全文总结与展望614．1结论．614．2创新之处．．614．3进一步工作设想．62参考文献63附录75作者简历及在学期间的科研实践85致谢87万方数据中国甜柿自然脱涩相关基因ADH和PDC的分离及功能验证摘要中国原产完全甜柿(简称“中国甜柿”或CPCNA)自然脱涩性状受显性基因控 制，而日本原产完全甜柿(简称“日本甜柿’’或JPCNA)受隐性基因控制，因而中 国甜柿较日本甜柿具有更重要的育种价值。中国甜柿自然脱涩机理明显有别于仅依靠“稀释效应”的日本甜柿，除“稀释效应’’外可能还涉及单宁的“凝固效应”，即 可溶性单宁与乙醛反应转变成不溶性单宁的过程。本研究以中国甜柿为试材，以非 完全甜柿(non．PCNA)和日本甜柿为对照，首先从中国甜柿中分离参与乙醛代谢的两个关键酶基因：乙醇脱氢酶基因(彳册)和丙酮酸脱羧酶基因(肋C)；进而通过分析其在不同脱涩类型(中国甜柿、日本甜柿和非