人ⅲ型胶原蛋白肽在嗜热链球菌中的高效表达及发酵优化.pdfVIP

摘 要 摘 要 胶原蛋白 （collagens ）是一类细胞外基质蛋白，是结缔组织的主要蛋白成 份，在维护各种组织的结构完整性方面，扮演着重要的角色。胶原蛋白富含多 种氨基酸，具有多种独特的结构，有着特异的组织分布，与一些器官的功能有 直接的关联，更关系到生物体的衰老。由于人源胶原蛋白的生产与使用存在着 伦理与道德的问题。所以本论文根据人 III 型胶原蛋白三肽功能区序列和合成生 物学标准部件设计原则，通过基因工程的方法对嗜热链球菌进行改造，使其高 产人 III 型胶原蛋白肽，从而避免了伦理与道德的问题。 本论文通过密码子优化的方法人工设计、优化并合成了 542bp 的人 III 型胶 原蛋白α1 链基因序列（col III ），包括了 4 个酶切位点、组氨酸标签及信号肽 序列。将该基因片段连同 nis I 抗性片段插入线性载体 pSB1C3 中，构成连接质 粒（pSB1C3-col III-nis I ）。将连接质粒转入大肠杆菌进行扩增，取质粒进行 双酶切 ，得到 目标片段 。将 目标片段插入载体 pMG36e 中，构成重组质粒 （pMG36e-col III-nis I ）。制备嗜热链球菌感受态，通过电击的方法将质粒转入 嗜热链球菌感受态细胞，构建嗜热链球菌工程菌。取工程菌质粒进行酶切鉴 定、PCR 产物测序与 SDS蛋白电泳鉴定。 本论文培养工程菌进行 Tricine SDS电泳检测分析，从中筛选出蛋白 质表达量最高且重组质粒稳定性最好的菌株。筛选最优细胞破碎法对工程菌进 行细胞破碎处理，将破碎后冷冻离心的胞外蛋白、胞内蛋白和包涵体蛋白进行 Tricine SDS电泳检测、Western Blot 检测，确认目标胶原蛋白肽表达于 胞内与包涵体。大量表达目的胶原蛋白肽并过镍柱纯化，得到高纯度的目标胶 原蛋白肽。 本论文制备空菌与工程菌的生长曲线，确认工程菌的生长不因基因改造而 发生变化。制备菌液 OD600 下的分光光度值与蛋白质浓度的关系曲线，发现其 具有正相关性。根据经济原则与高效原则，优化培养基碳源与氮源、培养温度、 红霉素浓度、温度、接菌量，分析得出最佳培养基配比与培养条件。培养基中 的碳源和氮源的最佳比例为 1%的葡萄糖，2% 的蛋白胨和 1%的酵母取物。将 菌液按 0.4% 的接菌量接种于含有 2.5mg/mL 的红霉素浓度的 ELL 培养基中，42 ℃ 培养，至 OD600 下的分光光度值为 1.5 左右，目标胶原肽的表达量最高，约占胞 内总蛋白的21.97% 。 关键词：胶原蛋白肽；蛋白表达；嗜热链球菌；Tricine SDS；Western Blot - I - Abstract Abstract Collagen is a class of extracellular stromatin. Its the major protein of connective tissue, which plays an important role in maintaining the integrity of the various organizations. Collagen not only has a unique structure and is rich in diversity and has specificity of tissue distribution but also have a close relationship with the function of organ and body aging. But the production and use of human collagen exists ethics and moral issues. According to the human type III collagen’s