pcr扩增uida、rfbe和flich7基因检测大肠杆菌 o157-h7特异性和灵敏性比较.pptVIP

湖北检验检疫局技术中心 赵晖 zhaohui@hbciq.gov.cn * 论文撰写背景： 本论文的研究内容是在澳大利亚伊丽莎白－麦克阿瑟农业研究所访问研究期间所做实验的一部分。 国外一直很重视对O157:H7的研究工作，完成论文时，刚好FDA公布了O157:H7的暴发事件。 这篇论文是专门为这次征文活动而写的，希望能完善和建立最适合检验检疫运用的O157:H7快速检验方法。 * 简介 本文中采用的是普通PCR检测方法，因为目前普通PCR已经是一种简单而经济的方法，在国外被广泛采用，趋于成熟和稳定，我们将这种方法用于日常检测应该是可行的。 本文所用的3种检测目的基因和4种致病基因是从众多的文献中筛选出来的。 * 实验目的 通过对PCR扩增uidA、rfbE和fliCH7基因检测大肠杆菌 O157:H7特异性和灵敏性的比较，以选择一种用于样品中O157:H7检测的最佳方法。 * 实验方法 用单一PCR方法分别扩增uidA、rfbE和fliCH7基因检测O157:H7和非O157:H7菌株31株，比较检测的特异性。用纯化的O157:H7基因组DNA以及从1.7×107 ～1.7个O157:H7细菌中提取的DNA为模板这两种方法比较分别扩增三种基因检测的灵敏度。 * 菌株 本试验所用菌株均为澳大利亚伊丽莎白－麦克阿瑟农业研究所 (Elizabeth Macarthur Agricultural Institute) 免疫微生物实验室保存菌株(表1)，所有大肠杆菌血清型均经墨尔本大学微生物系鉴定。 试验菌株分别接种于Luria-Bertani (LB)肉汤中，37℃，200 rpm振荡培养过夜（12～16 h）。 * 细菌DNA模板制备 快速加热法：用InstaGene Matrix试剂盒 (BIO-RAD, 澳大利亚)制备DNA模板。 纯化的DNA模板：用Promega 的DNA纯化试剂盒（Promega, 澳大利亚）制备纯化DNA。 * 试验用引物 目的基因 引物序列 产物大小(bp) 参考文献 uidA 5-GCGAAAACTGTGGAATTGGG-3 252 Cebula等[4] 5-TGATGCTCCATAACTTCCTG-3 rfbE 5-TCAAAAGGAAACTATATTCAGAAGTTTGA-3 159 Sharma等[5] 5-CGATATACCTAACGCTAACAAAGCTAA-3 FliCH7 5-GCGCTGTCGAGTTCTATCGAGC-3 625 Gannon等[6] 5-CAACGGTGACTTTATCGCCATTCC-3 * PCR反应 扩增rfbE和fliCH7基因的反应程序. 扩增uidA基因的反应程序 . * 致病基因的检测 所有大肠杆菌菌株均采用Adrienne W. Paton 和 James C. Paton的多重PCR方法检测4种大肠杆菌致病基因：stx1、stx2、eaeA和ehxA [3]。 * PCR检测的特异性 以包括O157:H7等血清型的18株大肠杆菌和13株非大肠杆菌的DNA为模板（快速加热法制备），以PCR方法分别扩增uidA、rfbE和fliCH7基因用于PCR特异性检测。 * PCR检测的灵敏度 采用两种方法测定 （1）用纯化的O157:H7的DNA为模板。 （2）用快速加热法分别提取梯度稀释的O157:H7菌悬液的DNA作为模板，同时对每个稀释梯度中的O157:H7进行平板菌落计数。 * 实验结果 特异性的比较结果：所有大肠杆菌 O157菌株扩增出了rfbE基因；O157:H7、H－、H1、HN、O75:H7和H－都扩增出了fliCH7基因；O157:H7、H－、H1和HN均扩增出uidA基因；其他菌株都没有扩增产物。 灵敏度的比较结果：（1）扩增三种基因的检测灵敏度均为10 pg纯化基因组DNA，（2）扩增uidA和rfbE基因，PCR检测的灵敏度均为1.7×102个细菌；扩增fliCH7基因，PCR检测的灵敏度为1.7×101个细菌。 * 菌株名称 血清型 来源 携带的致病基因 目的基因扩增结果 stx1 stx2 eaeA ehxA uidA rfbE fliCH7 大肠杆菌 O157: H7 腹泻病人 + + + ＋ + + + O157: H7 腹泻病人 + + + ＋ + + + O157: H- 腹泻病人 + + + + + + + O157: H- 腹泻病人 + + + + + + + O157:HNb 腹泻病人 + + + + + + + O157: H1 腹泻病人 +