细胞色素p450表氧化酶基因2j2抑制心肌肥厚的作用及其机制-急诊医学(心血管)专业论文.docx

二、体内实验P450表氧化酶基因2J2过表达抑制大鼠心肌肥厚的作用及其机制（一）实验方法：1.实验动物适应性喂养1周后，随机分为6组，每组6只SD大鼠，分别为：对照组注射生理盐水，pcDNA3.1组注射pcDNA3.1，pcDNA3.1-2J2组注射pcDNA3.1-2J2，AngII组注射生理盐水，AngII+pcDNA3.1组注射pcDNA3.1，AngII+pcDNA3.1-2J2组注射pcDNA3.1-2J2。实验开始前，采用ADI无创血压计记录尾动脉基础血压值。2. 真核表达质粒pcDNA3.1与pcDNA3.1-2J2的大量提取和纯化（应用碱裂解法提取，硅藻土纯化法纯化）；目的质粒pcDNA3.1-2J2与对照质粒pcDNA3.1经尾静脉注射导入动物体内，每种质粒注射的剂量是5mg/kg体重，空白对照组注入相同体积的生理盐水。在注射质粒的同时，切开背部皮肤，扩张皮下组织间隙，将含有AngII的压力调控微泵(Alzet2002)埋入动物皮下，清洁切口后迅速缝合切口。AngII的剂量按照500ng/kg/min的速度释放2周时间。在基因及微泵导入后的第3、7、10、14天，采用ADI无创血压计分别记录尾动脉血压。3.质粒注射及微泵植入2周后，留取24小时尿标本，在戊巴比妥钠麻醉下进行心脏超声检查。处死动物前，动物称重，麻醉后用Millar导管经右颈动脉插入左心室记录心脏血流动力学指标，随后留取血液标本；取心脏，测量大小后拍照记录，并称重计算心脏体重比；心脏，主动脉，肝脏，肾脏等组织放入液氮冷冻后转入-80℃低温冰箱保存备用，部分心脏组织标本放入甲醛溶液中固定，脱水浸腊石蜡包埋后室温保存备用。4.应用ELISA的方法检测动物心脏14,15-DHET和尿cGMP的含量，血清ANP的含量；应用Western blot的方法检测实验动物心脏CYP2J2和ANP的表达，以及P38MAPK、ERK的磷酸化表达，CnAβ的表达、NF-AT的核转位表达情况；对心肌组织切片进行HE染色和天狼星红染色，计算心肌细胞直径大小和胶原沉积情况。（二）实验结果：1.血压测量结果显示，与正常对照组比较，AngII导致了动物血压明显升高，而质粒pcDNA3.1-2J2则明显抑制了AngII诱导的血压升高(P0.05)。2.注射pcDNA3.1-2J2的大鼠心脏组织的CYP2J2表达显著增加；ELISA检测结果显示，pcDNA3.1-2J2和AngII+pcDNA-2J2组心脏14,15-EET的含量明显高于对照组(P0.05)。3.心脏超声检查结果显示，Ang II 使心脏室间隔和左室后壁明显增厚，pcDNA3.1-2J2抑制了室间隔和左室后壁的增厚(P0.05)。但是AngII和pcDNA3.1-2J2对射血分数(EF)和短轴缩窄率(FS)均没有明显影响。Millar 导管记录的血流动力学结果显示，结果显示AngII使左室舒张末压(LVEDP)明显升高，使左室压力最大下降速度(dp/dtmin)显著降低；pcDNA3.1-2J2降低了LVEDP，增加了dp/dtmin(P0.05)，但是心率(HR)，左室收缩末压(LVESP)，心输出量(CO)和左室压力最大上升速率(dp/dtmax)均未出现明显改变。4.AngII显著增加了心脏体重比，pcDNA3.1-2J2 抑制了心脏体重比的增加(P0.05)。心脏的HE 染色显示pcDNA3.1-2J2 显著抑制了Ang II 导致心肌细胞肥大(P0.05)，天狼星红染色显示pcDNA3.1-2J2显著改善了AngII导致的心脏胶原沉积(P0.05)。pcDNA3.1-2J2，AngII，AngII+pcDNA3.1，AngII+pcDNA3.1-2J2组动物的心脏ANP的表达和分泌均是增加的(P0.05)，同时尿cGMP排泄量也是增加的(P0.05)。Westernblot检测结果显示，与对照组比较，AngII组与AngII+pcDNA3.1组心肌组织中P-ERK，CnAβ，核内NF-AT的表达水平显著增加(P0.05)，pcDNA3.1-2J2显著抑制了心肌中P-ERK，CnAβ，核内NF-AT的表达水平(P0.05)，而对心肌中P-p38的表达水平无明显影响。结论1.外源性EETs和内源性EETs均能有效地抑制AngII导致的心肌细胞肥大，可能是通过促进ANP的表达和分泌达到抗心肌细胞肥大的作用。EETs促进ANP表达和分泌的可能机制是通过激活EGFR/PI3K/AKT/CREB信号通路。3.EETs抑制心肌细胞肥大的可能机制是：EETs激活ANP，ANP与其受体结合后，激活下游的第二信使cGMP，cGMP激活PKG，进而抑制CnAβ的表达以及NF-AT的核内转位。4.在动物体内，CYP2