天然化合物诱导klotho启动子活性及klotho启动子研究-基因组学专业论文.docxVIP

答辩委员会成员名单硕士学位论文答辩委员会成员名单姓姓名名职称称单位位备注注赖赖立辉辉教授授华东师范大学学主席席徐徐天乐乐研究员员中科院院院镇镇学初初研究员员中科院院院袁袁崇刚刚教授授华东师范大学学学谢谢东东研究员员中科院院院董董素珍珍助理研究员员华东师范大学学秘书摘要摘要心otho是一个新发现的衰老相关基因，习otho突变小鼠表现出如短寿、不育、异位钙化，动脉硬化、皮肤萎缩、骨质疏松和肺气肿等众多衰老症状，对丸otho过表达小鼠的分析表明丸otho蛋白作为激素有抑制衰老的功能。所以，筛选幻。tho 启动子激活剂，调节幻otho基因表达，提高幻otho基因表达对研究幻。tho蛋白功能和衰老机制，防治衰老相关疾病具有重要的意义。在之前的研究中，我们构建了幻otho 启动子一萤光素酶报告基因载体，转染人肾胚胎细胞HEK293，并利用0.0006%的双氧水处理(孵育6小时)转染后的细胞得到其氧化应激模型。利用该细胞模型，我们在天然产物中筛选出了一个能激活幻otho启动子活性的天然小分子化合物—紫花前胡内醋。本文中，我们在这一细胞模型上重新验证了这一化合物的活性，并测定了其EC 50值为1.60林留加1(6.6林M)。我们用500m 叭gday浓度的D一半乳糖注射IcR 小鼠6周，建立亚急性衰老模型小鼠，然后按sm叭gday和10m 叭gday 两种浓度给衰老模型小鼠腹腔注射紫花前胡内醋30 天，空白对照组和衰老对照组注射药剂溶剂，然后检查各组生化指标和衰老相关基因幻otho表达的变化。结果，衰老组红细胞SOD 水平较空白对照组显著下降，血清M DA 水平较空白对照组显著增高;而给予10m 叭gday和sm叭g.day 紫花前胡内酷能提高衰老模型小鼠红细胞s0D 水平，降低血清M DA 水平。衰老模型小鼠血磷、血钙水平较空白对照对小鼠都有显著上升，而给予10m叭gday 紫花前胡内醋能下调模型小鼠的血磷水平。此外肝脏中SoD水平和M DA 水平没有显著差异，’肾脏中心otho 基因的表达水平在各组中没有显著差异。为了研究幻otho基因的表达调控和其中紫花前胡内醋的响应元件，我们克隆了人租。tho基因5’端侧翼4.2Kb 长度的启动子序列。经生物信息学分析，租。tho基因启动子序列不含1人1人BOX 元件，在其转录起始位点有多个SPI 位点。我们构建了一系列5’侧翼或者3’侧翼缺失的启动子片段和萤光素酶报告基因重组质粒，并用来转染人肾胚胎细胞HEK293。其结果显示租。tho基因的核心启动子区域为转录起始点至一400bp，在一127bp到一243bp之间存在转录抑制因子结合位点，在一1.6Kb到一3Kb中存在远端调控区域。紫花前胡内醋的响应元件位于转录位点到一12几p之间。此外，用同样诱导氧化应激作用的百草枯处理细胞(150林M ，6 小时)能显著提高粗。山。基因启动子的活性，其响应区域为转录起始位点到摘要一127bp之间。本研究显示，氧化应激也能够诱导心oth。基因启动子的活性。关键词:幻。th。基因，D一半乳糖衰老小鼠模型，抗衰老作用，异紫花前胡内酷，氧化应激，启动子分析洲产物A bstract习otho 15anewlyidentified aging一suPPressorgene.Ithasbeen shownthatKlothomutantmieeshow anumberofaging一likePhenotyPes，suchasshortlifesPan，infertility，eetoPieealeifieation，arteriosclerosis，skinatroPh y，osteoPorosis andem Physem a.M oreover，over一exPression ofKlotho in m iee resultsin the ex tension oflifesPan.Therefore，sereening and identi fieation ofthe activatorof川oth o Prom otereouldbeusedforthedeveloPmeniofanti一agingagenis.InthePrev iousstudy，astableeelllinew asestablishedbytransfectingH EK2 93eellline w ith a vector eontaing a 1.6kbKlotho Prom oterfra乡11entlinked w ithluciferaserePortergene.Theeellswere treatedwith0.0006% h川rogenPeroxidefor6hour