Ames试验的准备.docVIP

Ames试验的准备 （一）仪器及器皿 1．仪器：双人双面洁净工作台、液氮罐、37C生化培养箱、恒温水浴箱、Ph测试仪、高压蒸汽灭菌器和干燥箱等。 2. 器皿：培养皿，配置用器皿，细菌接种环，滤膜片，移液枪及移液管灭菌干燥待用，紫外灯，尺子，秒表，无菌棉签等。 （二）鉴定菌株 1．计算所需平皿数，足够清洁的平皿用牛皮纸或棉布包好，放入高压蒸汽灭菌器灭菌，121°C，20min,然后置于干燥箱内烘干待用； 2.配制鉴定用培养基 1）营养肉汤培养基 2) 营养肉汤琼脂培养基平皿和斜面 3）上层培养基 4）底层培养基： ＶＢ液 ２０％葡萄糖溶液 3.配制鉴定菌株用试剂： 1)0.1%结晶紫水溶液 2) 0.8%氨苄青霉素碱性溶液 3) 0.8%四环素酸性溶液 4)0.1mol/L组氨酸溶液 5)0.5mmol/L生物素溶液 4.菌种准备 5.菌株鉴定 1）组氨酸需求试验（组氨酸营养缺陷鉴定） 结晶紫敏感试验（深粗糙型rfa鉴定） 3）紫外线敏感试验（ △ uvrB缺失的鉴定） 4）抗氨苄青霉素试验（R因子—抗氨苄青霉素的鉴定） 5)抗四环素试验（带质粒pAQl的鉴定） 自发回变试验 （三）菌株保存 基因型和生物学特性合格者，保存。 （四）增菌培养： （五）试剂及培养基 除说明外，应是化学纯，无诱变性。避免重复高温处理，选择适当保存温度和期限。 1.鉴定菌株用试剂： 2.配制培养皿用试剂 1）Vogel-Bonnet液10×(10倍浓缩)： 用途：用于配制底层培养基。 2）20%葡萄糖溶液 3.培养基 营养肉汤培养基； 营养肉汤琼脂培养基； 底层培养基； 表层培养基； （六）S9活化系统 10%Ｓ9混合液的配制：每10ml由以下成分组成，临时配制。（预试验大概需要11ml） 灭菌蒸馏水 3.8ml 磷酸盐缓冲液（0.2mol/L,pH7.4） 5.0ml 1.65mol/L氯化钾-0.4mol/L氯化镁溶液0.2ml 葡萄糖-6-磷酸溶液（0.05mol/L） 40μmol 辅酶Ⅱ液（0.05mol/L） 50μmol 肝S9液 1.0ml 混匀，置冰浴待用。 （七）对照 本实验阳性对照物见下表： Ames试验常用阳性对照 S9 TA97 TA98 TA100 TA102 TA1535 - 三硝基芴酮0.2μg/皿 三硝基芴酮0.2μg/皿 叠氮钠 1.5μg/皿 叠氮钠 1.5μg/皿 丝裂霉素 0.5μg/皿 + 2-氨基芴 10μg/皿 2-氨基芴 10μg/皿 2-氨基芴 10μg/皿 2-氨基芴10μg/皿或环磷酰胺200μg/皿 1,8-二羟基蒽醌 50μg/皿