双扩与凝集20100321.ppt

双向免疫扩散试验(沉淀 反应) 直接凝集试验（凝集反应） 免疫教研室 原理 用半固体琼脂凝胶作为介质，可溶性抗原、抗体在其中能自由扩散。将可溶性抗原和抗体分别加入琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如果抗原和抗体相对应，则在两者比例适当处形成白色沉淀线。 主要材料 器材：载玻片、EP管、微量加样器、枪头、打孔器、 注射器针头 试剂：生理盐水、琼脂粉、 抗原（正常小鼠IgG）、 抗体（兔抗小鼠IgG血清）  实验步骤 配制1%琼脂：用生理盐水配制，加热溶解 制板：趁热将3.5ml融化琼脂水平铺在玻片上，室温下冷却凝固 打孔：用打孔器按图示打孔 稀释抗体：取4支EP管，将抗体倍比稀释 加样：周围孔加入不同稀释度的抗体，中间孔加入抗原 琼脂板放入湿盒内，置4℃，24-48小时后观察结果。 3、结果观察： A、观察抗原与抗体间是否生成白色沉淀线，以出现可见沉淀线的抗体最大稀释度的那一孔为效价。 B、沉淀线的数目：如果生成一条线，说明只有一对抗原抗体特异性结合，如果出现数条沉淀线，则说明同时有数对抗原抗体对各自特异性结合。 主要材料 器材：酒精棉球、灭菌干棉球、微量加样器、 灭菌枪头、玻片、一次性采血针 试剂 抗A试剂（蓝色）、抗B试剂（黄色） 实验步骤 干净玻片上分别滴加抗A、抗B试剂各一滴 酒精棉球消毒无名指，采血针采血 用加样器加末梢血各1滴 不断转动玻片，使血液与试剂充分混匀，静止1-2min左右，观察结果 结果判断 注意事项 注意无菌操作 滴加血液时，不要使枪头尖触及试剂 应用 血型分析 病原微生物的快速诊断 抗体效价测定等 The End * * 抗原（antigen, Ag）: 能够刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与之特异性结合的物质。 抗体(antibody, Ab)： B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的可特异 性结合抗原的一组糖蛋白。 溶菌酶抗原（绿色）与抗溶菌酶抗体H链（黄）及L链（蓝）形成的抗原抗体复合物 反应条件： 适当的温度 电解质 酸碱度 特点： 特异性 可逆性 可见性（合适的抗原抗体比例） 　抗原-抗体反应的特点与影响因素 抗原-抗体反应的基本检测方法 凝集反应(agglutination):颗粒性抗原与相应的抗体结合，在一 定的条件下出现肉眼可见的沉淀物。 沉淀反应(precipitation):可溶性抗原与相应的抗体结合，在一 定的条件下出现肉眼可见的沉淀物。 补体参与的反应 补体结合试验、溶血空斑试验 免疫标记技术（immunolabelling technique）:用示踪物质标记 抗原或抗体，进行抗原-抗体反应的检测。 一、沉淀反应-双向免疫扩散试验 原理示意图 模拟图 染色标本图 1.抗原抗体双向自由扩散 2.24小时出结果 3.呈现沉淀线或弧 Ag 1 2 3 4 5 control n.s Ab 50uL 50uL 1 2 4 1:1 1:2 1:4 1:16 １、取４个空ＥＰ管，每管加５加入５0U生理盐水（ＮＳ） ２、从Ａb管中取５0U加入第一个管，,混匀后取50移入第二个管,依次进行. Ab 50uL 50uL 50uL 50uL C、沉淀线的位置、外形、与反应物的浓度、分子量有关 1 2 3 4 5 N.S 1.检测未知抗原或抗体 2.抗原性质分析 3.抗体效价滴定 4.抗原或抗体纯度鉴定 应用 二、凝集反应 原理 颗粒性抗原(完整的病原微生物或红细胞等)与相应抗体特异性结合，在有电解质存在的条件下，形成肉眼可见的凝集团块。 基本类型 直接凝集反应、间接凝集反应、凝集抑制反应等。 直接凝集实验（ABO血型鉴定） A B 抗A 抗B A + - B - + O - - AB +