梅花鹿鹿茸双向电泳蛋白提取条件筛选Thetwo-dimensional.PDF

梅花鹿鹿茸双向电泳蛋白提取条件筛选 1 1 1 刘华淼 ， 邢秀梅 ， 杨福合 （1.中国农业科学院特产研究所，吉林省特种经济动物分子生物学国家重点实验室，农业部特种经济动物 遗传育种与繁殖重点实验室，吉林省特种经济动物分子生物学重点实验室，吉林长春 130112） 摘要：根据鹿茸组织血液含量较高、骨化较为严重的特点，设计了三种适合双向电泳的鹿茸提取方法。筛 选出2D-cleanup 纯化为梅花鹿鹿茸双向电泳的最佳提取方法。 关键词：鹿茸；蛋白质组；蛋白提取 The two-dimensional electrophoresis optimization of sika deer antler LIU Hua- miao1 ，XING Xiu- mei1 ，YANG Fu –he1 （1.Institute of Special Animal and Plant Sciences of CAAS ，State Key Laboratory of Special Economic Animal Molecular Biology，Key Laboratory of Special Economic Animal Genetic Breeding and Reproduction ，Ministry of Agriculture ，Jilin Province Key Laboratory of Special Economic Animal Molecular Biology，ChangChun JiLin China ，130112） Abstract ：We designed three experiments according to higher blood levels of deer antler tissue and more severe ossification,2D-cleanup purified protein was best extraction method for two-dimensional electrophoresis of sika deer antler. Key words: velvet; proteome; protein extraction 鹿茸位居动物药之首，有效成份至今不清，鹿茸中蛋白成份也不清。通过双向电泳技术， 开展鹿茸蛋白质组学研究，挖掘鹿茸特异蛋白，为鹿茸蛋白应用研究奠定基础。鹿茸组织由 软骨组织和骨组织组成，富含血管和神经，2-DE 图谱的分辨率和重复性很差。 本研究通过直接裂解法、TCA-丙酮沉淀法、2D-cleanup 纯化法提取鹿茸蛋白，筛选出 适合双向电泳的鹿茸组织蛋白最佳提取条件。 1 材料与方法 1.1 材料 四锯梅花鹿二杠鹿茸取自中国农业科学院特产研究所鹿场。生长期为 40 天， 去茸皮，切成3mm ×3mm 小块，生理盐水冲洗鹿茸组织中的血液，于-80℃超低温冰箱保存。 1.2 主要试剂 尿素、硫脲、CHAPS、二硫苏糖醇（DTT ）、两性电解质（Bio-Lyte ）、Tris、 丙烯酰胺、甲叉-双丙烯酰胺、甘氨酸、十二烷基磺酸钠（SDS）、过硫酸铵、四甲基二乙胺 （TEMED ）、碘乙酰胺、Mineral oil 、17 cm pH4~7 干胶条、Clean-up Kit 蛋白纯化试剂盒、 甘油、甲醇、乙酸。 1.3 鹿茸组织蛋白提取 从-80℃冰箱中取出预先切成小块的鹿茸组织块，用低温冷冻研磨 机研磨成粉末。（说出条件） 1.3.1 直接裂解法 将研磨得到的鹿茸粉末按照 1 ︰5 （W/V ）的比例加入蛋白裂解液（7M 尿素、2M 硫脲、4%CHAPS 、65mM DTT 、0.2% Bio-Lyte 、1mmol/LPMSF），冰上裂解2 小 时，4 ℃、20000g 离心30min，取上清-80℃保存。 [1] 1.3.2 TCA-丙酮沉淀法 参照骨细胞蛋白提取文献 。称取 0.2g 鹿茸组织研磨粉末，将粉 末转至 1mL 离心管中加入4 倍体积-20 ℃预冷丙酮（含体积分数为10%的TCA 和体积分数 为0.07