中国医科大学《免疫学》实验二 脾细胞提取及计数.pptVIP

Department of Immunology Department of Immunology Department of Immunology 免疫学教研室 张学星 T 致敏T细胞 抗体 B 浆细胞 实验设计 眼球取血材料 免疫两周的小鼠（两人一只） 眼科弯镊子 麻醉剂（水合氯醛） 5ml注射器 微量离心管6个 微量离心机 眼球取血方法 小鼠腹腔注射麻醉剂0.4ml 2min后抓住小鼠颈部皮毛，轻压在鼠笼上 左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出 用眼科弯镊压入眼球深部，带着结缔组织，匀速夹出眼球 用微量离心管接住流出的血液，标记 每次采血量约0.5-1ml 小鼠抓取 用左手拇指和食指捏住小鼠尾巴中部，放在铁笼上，小鼠自然向前挣扎； 用另外三个手指压住小鼠的尾巴根部握入手掌； 放松拇指和食指，用另外三个手指控制小鼠尾部，然后用食指和拇指捏住小鼠头部两边疏松的皮肤提起小鼠； 注意：小鼠尾巴的尾端容易断裂，抓小鼠应抓尾巴中部或根部。 血清分离 静置2h后 离心10,000rpm，10～15min 收集血清到新1.5的Ep管，标记后 －20℃保存 ELISA法检测抗体水平（第三次实验） 脾脏 人类最大的免疫器官 捕获血源性抗原 储存血液 脾细胞分离材料 免疫两周的小鼠 PBS（磷酸盐缓冲液） 70%酒精 细胞裂解液（0.17mol的NH4Cl ） 动物解剖器械（平镊、齿镊、剪刀） 注射器（5ml）、平皿、Ep管、15ml离心管、离心机 取脾 将眼球取血后的小鼠颈椎脱位法处死 70%酒精浸湿皮毛，右侧卧位 左侧肋骨最低点与髋关节间做2.5cm切口 镊子钝性分离结缔组织，暴露腹膜 腹膜做2cm切口，暴露脾脏 分离结缔组织和系膜 脾脏放入5mlPBS的平皿中 冲洗法提取脾细胞 平镊轻轻夹住脾 注射器吸取平皿中5mlPBS，匀速注射入脾脏，冲洗脾细胞 拔掉针头用注射器吸取平皿中PBS反复冲洗3次，脾脏由暗红色变为白色 把所获得的细胞悬液收集到离心管内，PBS补齐至8ml 脾细胞悬液制备 1500rpm离心10min，去上清 加2ml红细胞裂解液，悬起细胞，可用加样器吹打混匀细胞，室温静止5min， 加6mlPBS后，1500rpm离心5min，去上清 5ml的PBS悬浮细胞，2000rpm离心10min，去上清 制成1ml的PBS细胞悬液 注意事项 脾脏很脆，一定要用平镊轻夹 分清脾脏和肝脏，不要去错器官 冲洗脾细胞时针头不能穿透脾脏 倾倒上清时沉淀贴壁面朝上，可剩余少量上清，防止误倒细胞 红细胞裂解液4℃保存 解剖器械用后及时清洗 脾细胞计数材料 0.4%台盼兰染液（死细胞被染为蓝色） 细胞计数板 盖玻片 显微镜 微量加样器 光学显微镜 安放好载玻片 打开电源 调整瞳孔间距 调整光源 镜头聚焦（先粗调，再微调） 10×物镜找到细胞层和计数室 40×物镜找到白细胞计数区域 细胞计数板（HEMACYTOMETER） 表面雕刻有带刻度的计数室用来计数细胞和微粒的特制玻璃板 细胞计数板 脾细胞计数方法 细胞浓度=稀释倍数×4个方格的平均数×104/ml 计数红细胞 细胞浓度=稀释倍数×5个小方格总数×5×104/ml 脾细胞计数方法 台盼兰10倍稀释脾细胞悬液 盖玻片盖好计数板 取10ul注入计数板与盖玻片夹层 40X物镜下计数细胞 活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100% 计算细胞原液浓度 调整细胞浓度至2×l06/ml 收集血清 10000rpm离心10min 微量加样器沿管壁缓慢吸取血清并转移至新Ep管，标记 保存在－20℃冰箱备用 注意勿将红细胞吸出 淋巴细胞的分离 E花环分离法 尼龙纤维分离法 免疫荧光法 流式细胞术 磁珠分离术 T细胞 CD2 （E受体） sRBC T细胞 CD4 淋巴细胞的功能检测 免疫细胞数量的检测 免疫细胞的功能检测 淋巴细胞增殖检测 淋巴细胞亚群检测 NK细胞活性检测 特异性CTL功能检测 巨噬细胞吞噬功能检测 细胞毒检测技术 混合淋巴细胞培养 试验台回复初始状态！！！ 平皿、鼠板冲洗干净倒放在实验台上； 15ml离心管冲洗干净倒放在试管架上； 5ml注射器冲洗干净倒放在试管架上； 红细胞裂解液、麻醉剂、PBS上交； 每组清点手术器械（1把手术剪刀、2把齿镊、2把平镊、1把眼科镊）并冲洗干净上交； 清理实验台垃圾。 * 红髓，白髓 Department of Immunology Department of Immunology Department of Immunology * 红髓，白髓