中国医科大学《免疫学》二 免疫血清的分离及脾细胞分离、计数.pptVIP

a.计数液10倍稀释方法： 脾细胞试管离心后弃上清，向离心管中加入1mlPBS液，充分混匀，取一支1.5ml EP管，用枪加入900ul PBS，再用枪吸取100ul 细胞悬液，并来回吹打几次，混匀。即为10倍稀释液。 b.脾细胞计数方法： 两人一块计数板(一桌两块），将其清洗干净，用酒精擦拭，用纱布擦干。盖上盖玻片；将EP管盖好盖，细胞悬液应混匀后用微量加样器吸取10微升混匀液从盖玻片一侧以一定的速度打入计数板，防止气泡产生。10ul液体足以添充满孔槽。 c.计数板读取： 原则是从左到右S形计数，数上不数下，数左不数右； 脾细胞浓度（个/ml)=（四大格细胞总数除以四）X 稀释倍数（10） X 104 （因为每个大格长宽高分别是1mm,1mm,0.1mm) 注意：如果发现细胞团块，能看清个数就按个数计算，看不清就按1个细胞计算 台盼兰10倍稀释脾细胞悬液 盖玻片盖好计数板 取10ul注入计数板与盖玻片夹层 40X物镜下计数细胞 活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100% 计算细胞原液浓度 调整细胞浓度至2×l06/ml 10000rpm离心10min 微量加样器沿管壁缓慢吸取血清并转移至新Ep管，做好标记，方便下次取用。 保存在－20℃冰箱，下次课ELISA使用 注意勿将红细胞吸出，小心吸取，勿触及沉淀。 外周血单个核细胞分离原理 免疫细胞检测-数量和功能检测 密度梯度离心法-如外周血单个核细胞的分离 黏附分离法 荧光激活分离法-FACS 磁性分离法-MACS 其它分离法 细胞的沉降速度 = 2r2(Q-Q0) 9qh Xg Q:颗粒比重 Q0:溶质比重 r： 颗粒半径 q：形状因子=颗粒摩擦系数/同体积球型颗粒摩擦系数 h：粘稠度 g=相对离心力 血小板 淋巴细胞 红细胞 粒细胞 密度 直径(u) 1.04-1.06 1.06-1.08 1.08-1.09 1.09-1.10 8-10 13 7.5 离心前 离心后 E花环分离法 尼龙纤维分离法 流式细胞术 磁珠分离术 T细胞 CD2 （E受体） sRBC T细胞 CD4 流式细胞术（FACS) 磁珠分离术 磁珠分离术(MACS) 免疫细胞数量的检测 免疫细胞的功能检测 淋巴细胞增殖检测 淋巴细胞亚群检测 NK细胞活性检测 特异性CTL功能检测 巨噬细胞吞噬功能检测 细胞毒检测技术 混合淋巴细胞培养 巨噬细胞吞噬功能检测 平皿、鼠板冲洗干净倒放在实验台上； 10ml离心管冲洗干净倒放在试管架上； 5ml注射器冲洗干净倒放在试管架上； 红细胞裂解液、麻醉剂、PBS上交； 每组清点手术器械（2把手术剪刀、2把齿镊、2把平镊、2把眼科镊）并冲洗干净上交； 核对、检查微量加样器，调制最大量程。 清理实验台垃圾。 * 红髓，白髓 Department of Immunology 免疫学教研室 张学星 二 免疫血清的分离及脾细胞分离、计数 T 致敏T细胞 抗体 B 浆细胞 免疫应答 体液免疫 细胞免疫 Ag-Ab反应 Ab检测 凝集反应 ELISA 脾细胞制 备及计数 眼球取血、分离血清 认识脾脏、取脾，制备脾细胞悬液及细胞计数 固有免疫应答 操作一： 血清、血浆、全血区别？ 为什么分离血清？ 血清：血液自然凝固后析出的淡黄色液体。 血浆，血液中的液体成分，即除去细胞成分，血液抗凝离心后的液体。 血清与血浆比较，组分更简单，同样含有目的抗体。 免疫两周的小鼠（两人一只、取回自己的实验动物） 眼科弯镊子 麻醉剂（4%水合氯醛） 1ml注射器 1.5ml微量离心管2个 微量离心机 小鼠腹腔注射麻醉剂0.4ml 2min后抓住小鼠颈部皮毛，轻压在鼠笼上 左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出 用眼科弯镊压入眼球深部，带着结缔组织，夹出眼球 用微量离心管接住流出的血液，标记 每次采血量约0.5-1ml 播放视频 静置2hrs（为什么？） 离心10,000rpm，10min 收集血清至新Ep管，标记 －20℃保存 ELISA法检测抗体水平（第三次实验） 人类最大的免疫器官 捕获血源性抗原 储存血液 再次免疫一周的小鼠 PBS（磷酸盐缓冲液）-维持细胞等渗环境。 70%酒精-消毒 细胞裂解液（0.17mol的NH4Cl ）-优先裂解红细胞 动物解剖器械（平镊、齿镊、剪刀） 注射器（5ml）、平皿、Ep管、10ml离心管、离心机 将眼球取血后的小鼠颈椎脱位法处死 70%酒精浸湿皮毛，右侧卧位 左侧肋骨最低点与髋关节间做2.5cm切口 镊子钝性分离结缔组织，暴露腹膜 腹膜做2cm切口，暴露脾脏 分离结缔组织和系膜 平镊夹取脾脏放入含5m