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快速耐药检测技术HAIN 国家参比室 李 强 背景 国际结核病流行 中国是全球22个结核病高负担国家之一 MDR/XDR日趋严重 现行的实验室技术不能满足临床工作需要 应对策略 控制传染源：早期发现 TB 切断传播途径：规范治疗-快速诊断 MDR 新技术 LED LAMP Liquid culture Gene probe Gene chip Hain Hain 技术 分子生物学快速检测方法 MTBCM-鉴定TB和NTM MTBC-鉴定TB复合群 MTBDRplus-鉴定耐药 原理 Hain 技术是基于PCR扩增的检测方法。扩增后的产物与预先固化在膜上的特异性探针杂交，通过显色反应判断结果。 MTBCM 原理：PCR扩增、与探针特异性杂交，鉴定鸟分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌、戈登分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、结核分枝杆菌复合群等15种。 标本：培养物 MTBC 原理： PCR扩增、与探针特异性杂交，进行结核分枝杆菌复合群鉴定：非洲分支杆菌、牛分支杆菌、BCG、田鼠分支杆菌和结核分枝杆菌。 标本：培养物 MTBDRplus 方法 原理：PCR扩增检测rpoB、katG和inhA基因突变位点,诊断RIF和INH耐药。 标本：培养物、涂阳痰标本等。 优点：时间短，操作简单，特异性高。 应用：南非大规模应用。 MTBDRplus 操作流程 MTBDRplus inhA 197例临床标本耐药检测分析 标本：临床分离株 方法: 煮沸法提取核酸 PCR扩增 杂交 RFP 检测结果 INH检测结果 结果评估 结论 Hain 技术可以快速检测RIF和INH的耐药 操作简单 特异性和灵敏度较高 缺点：检测的药物少；结果靠肉眼判断，有一定主观性。 * * DNA提取 用NALC/NaOH 处理痰标本 2) PCR扩增 3) 杂交 扩增产物和 固化在 膜上的特异性探针杂交 4) 结果判读 rpoB 野生型探针: WT1 - WT8 rpoB 突变探针: MUT1-3: D516V, H526Y, H526D, S531L → 野生型缺失 → 野生型突变 MTBDRplus rpoB 511 513 516 518 522 526 531 533 rpoB WT2 rpoB WT4 rpoB WT6 rpoB WT8 rpoB WT7 rpoB M UT1 (D516V) rpoB MUT3 (S531L) rpoB M UT2A (H526Y) rpoB M UT2B (H526D) 514 515 rpoB WT1 rpoB WT3 rpoB WT5 509 508 505 katG 基因突变 MTBDRplus katG S315T2 KatG MUT2 S315T1 KatG MUT1 315 KatG WT 突变 突变探针 区域 野生探针 T8A InhA MUT3B T8C InhA MUT3A -8 InhA WT2 A16G InhA MUT2 -16 C15T InhA MUT1 -15 InhA WT1 突变 突变探针 区域 野生探针 inhA 基因突变 MTBDRplus 反应条带(示范) 82 13 无突变 95 13 101 突变 114 RFP 敏感 RFP 耐药 85 23 无突变 108 1 88 突变 89 INH 敏感 INH 耐药 78.7 98.8 INH 敏感 98.9 79.3 INH 耐药 86.3 98.8 RFP 敏感 99 88.6 RFP 耐药 特异性（%） 敏感性（%）