EMSA详细步骤.docVIP

电泳迁移实验(EMSA)方法 ? 1. 探针的标记： （1） 如下设置探针标记的反应体系：待标记探针 （1.75pmol/微升） 2微升T4 Polynucleotide Kinase Buffer （10X） 1微升Nuclease-Free Water 5微升[γ-32P]ATP（3，000Ci/mmol at 10mCi/ml） 1微升T4 Polynucleotide Kinase （5-10u/微升） 1微升总体积 10微升 按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4 Polynucleotide Kinase，混匀。 （2） 使用水浴或PCR仪，37反应10分钟。 （3） 加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。 （4） 再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。 （5） 标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20。 2. 探针的纯化： 通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如 下步骤操作： （1） 对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵，