间充质干细胞通过可溶性因子介导白血病细胞耐药的初步分析-儿科学专业论文.docx

间充质干细胞通过可溶性因子介导白血病细胞耐药的初步研究中文摘要研究背景白血病是小儿恶性肿瘤中发病率最高的一种，虽然大多儿童的急性白血病能 通过化疗治愈，但耐药及治疗相关毒性仍是其治疗中面临的重要挑战。近年来， 靶向肿瘤微环境的辅助化疗逐渐成为肿瘤领域研究的热点。在过去十年的研究中，人们发现在造血微环境中骨髓造血干细胞和周边细胞 的相互作用及影响，造血细胞的生长由骨髓基质细胞通过产生细胞因子?趋化因 子和由细胞黏附为起点的细胞内信号紧密调节?造血微环境在骨髓腔中定位于 “干细胞龛”，后者是造血干细胞(Hematopoietic Stem Cell,HSC)聚集的地方，包括成骨细胞(骨内膜)龛和血管龛，分别给促成造血的长期 HSC 及周期活跃的短期HSC 提供一个微环境，协同调节 HSC 的自我更新?增殖?分化和在骨髓内外的移 动?骨髓微环境中特殊的―龛‖为肿瘤细胞提供一个逃避化疗毒性凋亡的居所并获 得耐药表型。作为骨髓微环境中的重要成员，MSC 是存在于血窦表面并促成窦壁结构产生 的自我更新的祖细胞，产生血管生成素-1 并能产生成骨细胞，形成骨内膜龛?MSC 产生功能不同的细胞(成骨细胞和脂肪细胞)，形成不同的结构(骨表面和窦壁)， 是组成造血微环境的关键成分，在支持造血中扮演一个重要的角色? MSC 还是 一种具有高度自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，其重要特点是能够逃避免疫识别、抑制免疫反应，也因此成功的被应用于临床上许多疾病的治疗中，如移 植物抗宿主病、自身免疫性疾病、心肌梗死及神经系统疾病等。但与此同时，它 在多种肿瘤体系中被证明能通过多种粘附和非粘附机制及其多重信号通路引起 肿瘤耐药。血液恶性肿瘤病人的化疗后 HSC 和 MSC 共移植研究表明，同时植入 MSC和 HSC 的病人，比起只植入 HSC 的病人有更高的复发率。这种复发率的升高，不能排除与 MSC 导致的耐药有一定的相关性，有待进一步研究证明。而在体内 实验中，发现 MSC 和肿瘤细胞混合注射的小鼠平均肿瘤容量大，也提示了 MSC 对肿瘤的促进作用。尽管 MSC 在骨髓中的数量不多，但 MSC 及其衍生的基质细胞分泌的可溶 性因子通过旁分泌作用在骨髓龛中直接作用于肿瘤细胞。其中，MSC 分泌的细 胞因子白介素-6(IL-6)在当中扮演着重要角色。MSC 通过可溶性因子 IL-6 介导的 耐药涉及黏附依赖性机制及非黏附依赖性机制及多重信号通路，这些信号传导途 径通过调节 Bcl-2 等基因的表达，促进细胞生长、分化和抗凋亡。此外，以环氧化酶 2(Cycloxygenase，COX-2)为关键酶的前列腺素 E2 在 MSC 介导的耐药中也有重要作用。COX-2 通过抑制神经鞘磷脂酶的活性和神经酰胺 的产生，及调节抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达、Akt 通路活化及细胞对 NO 的易感性， 从而对抗凋亡。依托考昔作为改良后的 COX-2 抑制剂，在肿瘤的防治中可能仍 有很大发展空间。实验目的1． 了解急性白血病患儿骨髓上清及间充质干细胞培养上清的 IL-6 水平，探讨其 临床意义。2． 探索间充质干细胞分泌的可溶性因子通过非粘附介导的机制对 Jurkat、K562、 K562/A02 等白血病细胞株在细胞毒性药物处理下的保护作用。3．探讨 COX-2 抑制剂依托考昔对 MSC 的可溶性因子介导耐药的干预作用。实验方法1． 从骨髓中分离单个核细胞，体外培养间充质干细胞，制备间充质干细胞条件 培养基。2． 用流式细胞仪鉴定 MSC 表面 CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、 CD19、HLA-DR 抗原。3． 酶联免疫法检测非白血病和白血病儿童骨髓上清及骨髓分离培养的 MSC 培养液中 IL-6 的含量。4． MSC 条件培养基作用于白血病细胞株 Jurkat、K562 及 K562/AO2，流式细胞 仪检测多柔比星诱导的白血病细胞株的凋亡率，检测白血病细胞株的细胞周期。5．荧光定量 PCR 检测 Bcl-2、Mcl-1、COX-2 基因表达量。6． 改良 MTT 法检测细胞株在多柔比星、柔红霉素、长春新碱、阿糖胞苷、门 冬酰胺酶、地塞米松等化疗药物诱导下的药物抑制曲线及依托考昔干预下的药物 抑制曲线。7． 用 COX-2 抑制剂依托考昔干预，检测多柔比星诱导下白血病细胞株凋亡率 及细胞周期，和 Bcl-2、Mcl-1、COX-2 基因表达量。技术路线第一部分第二部分第三部分急性白血病患儿骨髓Jurkat 或K562 或COX-2 抑制剂依托考昔离分K562/AO2心离细胞株骨髓上 清液单个核 细胞MSC 条件 培养基贴壁培养 鉴定抗原MTT 法检测 各种化疗药 物的药物抑 制曲线ELASA 检测 IL-6 水平流式细胞 仪检测