微生物工程---发酵培养基的优化.ppt

灵芝胞外多糖深层发酵培养基的优化瑚珊 培养基主要成分 菌种 灵芝(Ganoderma lucidum) 碳源:葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、术糖，酒糟；玉米粉。 氮源:麸皮、豆饼粉,酵母营、蛋白胨、尿素、硫酸铵 实验方法 种子培养 1)斜面培养基PDA． 2)液体种子培养基(g／L)：葡萄糖20；玉米粉10；麸皮5;KH2PO4 1．5；MgSO4 2．5． 3)液体种子培养：将斜面菌种转接到250 mL三角瓶，装液量80 mL．30℃和150 r／min条件下培养7 d．以10%的接种量转到500mL三角瓶中培养3～4 d作为发酵罐接种物。 深层发酵 25 L发酵罐中培养基体积12．5 L，发酵温度30℃，通风量：0．75 m3／h，搅拌转速180 r／min，接种量1．25 L，发酵时间96 h． 细胞干重法测定生物量．按下式计算生物量(g／L)： 生物量= (DCW／V)×106 ．式中DCW 为细胞干重(g);为取样体积(mL)． 乙醇沉淀法测定粗多糖 营养性因子对灵芝多糖深层发酵的影响 碳源 葡萄糖及成分较复杂的复合碳源(玉米粉及酒糟)有利于苗丝体的生长和胞外多糖的分泌。其原因可能来自两方面，一是酒糟等碳源中含有的其它营养成分(各种维生素类等)有利于菌体的生长；二是酒糟中含有的纤维素、半纤维素和核苷酸类物质作为菌丝体胞外多糖合成的前体诱导物而促使胞外多糖的大量合成。 营养性因子对灵芝多糖深层发酵的影响 氮源，以酵母膏、麸皮为氮源时，生物量及胞外粗多糖产量较高；以有机氮源进行灵芝深层发酵时菌体生物量及胞外菌球多糖的产率都明显高于无机氮源，可见灵芝菌丝体对有机氮源的利用能力要优于无机氮源。作者认为NH“的存在不利于灵芝多糖的形成。 C／N比对灵芝多糖深层发酵的影响 碳源浓度的影响 ，葡萄糖质量浓度太高和太低都不利于胞外多糖产率的提高，太低时营养基质用于长菌体的比例增加；在葡萄糖质量浓度大于60 g／L时，延滞期要滞后24 h左右，这表明较高质量浓度碳源对菌体生长具有抑制作用。因此灵芝多糖发酵的碳源质量浓度应控制在2O～40 g／L． C／N比对灵芝多糖深层发酵的影响 氮源质量浓度的影响，氮源质量浓度太高时，生物量明显提高，胞外多糖产量下降；在氮源质量浓度太低时，菌体生长不良，多糖产量也下降 只有在适宜的氮源质量浓度(1～3 g／L)下，菌体才能够兼顾其生长和多糖的形成从上面的实验结果我们可以看出，较高c／N 比有利于灵芝胞外多糖形成 正交实验优化发酵培养基 由上述的营养因子实验及c／N 比实验可以看出，培养基的组成及各成分间的比例对菌体生长和多糖产量有较大的影响，根据已有的实验结果，考虑到再生资源的利用，我们通过正交实验优化发酵培养基组成。 由上表可以看出酒糟的极差最大，其次是玉米粉、麸皮和葡萄糖，这说明酒糟对胞外粗多糖的影响最大 为直观地反应各因子对指标的影响，作出因子和实验指标的关系图3～6． 由图中可以看出葡萄糖的极差最小，因而图形的波动最小；而酒糟的极差最大，其图形的波动也最大，对指标的影响也就越大。各因素的主次顺序为。 表5的方差分析结果中可以看出，因子A在99%的置信度下对指标的影响高度显著；因子B和D在95%的置信度下对指标的影响显著。因此，培养基的最佳组合是A3，B2，C2，D3，即酒糟80 g/L(含水量75%)，葡萄糖lO g/L，玉米粉10 g/L，麸皮5 g／L．在此组合下，在25 L的发酵罐上经60%乙醇沉淀，胞外多糖的最高产量达2．35 g/L. 实验结论 1)碳源实验结果显示，葡萄糖、玉米粉和酒糟有利于胞外多糖的形成，其原因可能与复合碳源中含有的多糖合成前提物质有关。氮源实验表明，酵母膏和麸皮是较适宜的灵芝深层发酵氮源，而无机氮源不利于灵芝菌体的生长。 2)C／N 比实验表明，较高的C／N 比有利于胞外多糖的形成 3)正交优化实验确定的灵芝多糖深层发酵的最佳培养基组成(g／L)为：酒糟80(含水量75 %)，葡萄糖lO，玉米粉1O，麸皮5.在此组合下，在25 L的发酵罐上发酵胞外多糖(60%乙醇沉淀部分)的最高产量2．35 g／L，加上30%乙醇沉淀部分(0．56 g／L)，共计2．91 g／L，已超过目前文献报道的最高值2．8 g／L． * * * *