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细胞苗培养技术 一、制备细胞用物品的处理及准备 玻璃器皿的处理 橡胶制品的处理 物品的准备 1·玻璃器皿的处理 先用自来水简单刷洗，然后用清洁液浸泡过夜，不应少于6小时，以中和其中的碱物质，用水冲洗 再用毛刷沾洗涤剂刷洗，刷洗要适度，过度会损害器皿表面的光泽度 需流水冲洗十次以上，然后用注射水清洗3-5 次，晾干备用 清洁液 常用三种：重铬酸钾（g）浓硫酸（ml）蒸馏水（ml） 强清洁液 63∶1000∶200 次强清洗液 120∶ 200∶1000 弱清洁液 100∶ 100∶1000 配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停的用玻璃棒搅拌，使产生的热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液一般为棕红色 2.橡胶制品的处理 胶塞类橡胶用品，先用蒸馏水浸泡，然后用2%NaOH溶液煮沸15～20 min，用自来水冲洗干净 再用 1％稀盐酸溶液浸泡30 min，再用自来水冲洗 纯化水漂洗2～3次，最后注射水漂洗1次，烤干后备用。 3.物品的准备 1000ml烧杯、500ml烧杯、平皿、剪子、眼科镊子、抽滤瓶、注射器、单根管道、长管道、抽滤瓶塞子、500ml瓶塞、消化瓶、转瓶  10倍汉克氏液、10倍乳汉液、犊牛血清、7.5%碳酸氢钠、0.25%胰蛋白酶、双抗、注射水 细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。 需要用新鲜的注射水或去离子水 细胞培养的最大危险是发生培养物的细菌、真菌和病毒等微生物的污染 湿热（高压蒸气灭菌法）：126℃，60min 干烤：160℃, 2 小时 二细胞培养用溶液的配制及保存 10倍浓缩乳汉液（10000ml）保存于2-8℃ 氯化钠 800g 氯化钾 40g 七水硫酸镁 20g 二水磷酸氢二钠 15.2g 磷酸二氢钾 6g 无水氯化钙 14g 葡萄糖 110g 1%苯酚红 60ml 水解乳蛋白 500g 0.25%胰蛋白酶（10000ml)保存于-15℃ 氯化钠 　　80ｇ 氯化钾 　　2ｇ 二水合枸橼酸三钠　　9.46ｇ 磷酸二氢钠　　　　　0.56g 碳酸氢钠 10g 葡萄糖 110g 7.5%碳酸氢钠（10000ml)保存于2-8℃ 碳酸氢钠 750g 双抗溶液（20000μ/ml）保存于-15℃ 青霉素 125瓶*160μ 链霉素 200瓶*100μ 灭菌方法 培养细胞所用溶液的除菌方法，均为0.22微米过滤除菌。 每次配好后留样，培养72小时，观察培养液确实没有污染后使用 平衡盐液体的作用 组织细胞培养中常用的基本液体，可以维持渗透压、调节pH值、供给细胞生存所需的能量和无机离子成分 用于洗涤组织、细胞等 胰蛋白酶溶液的作用 主要作用：使细胞间的蛋白质水解，使细胞相互离散 消化完细胞时，加入一些血清或含血清的培养液，能终止消化作用 酚红的作用 大多数培养液中使用酚红作为pH 指示 红色表示中性pH，黄色代表酸性pH，紫色表示碱性pH 在一些特殊培养液中不含酚红 血清的作用 提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养物质。 血清还含有多种未知的促细胞生长因子、促贴附因子及其他活性物质，能促进细胞的生长、增殖和贴附。 三、鸡胚成纤维细胞的制备 流程图 SPF种蛋─10日发育健康胚─胚表面消毒─无菌手术取出鸡体─洗2-3次─去头─剪碎组织─洗2-3次─加入0.25%胰蛋白酶36.5-37.5℃消化（期间每过5-10分钟轻摇一次）─分散过滤细胞─分入转瓶温室培养36.5-37.5℃ 由于有关培养的每个环节的失误均能导致培养失败，故细胞培养的每个环节都应严格遵守操作常规，防止发生污染 贴壁细胞一般有两种形状,即上皮细胞形和成纤维细胞形细胞。 上皮细胞形细胞呈扁平的不规则多角形,圆形核位于中央,生长时常彼此紧密连接成单层细胞片。 成纤维细胞 成纤维细胞形细胞形态与体内成纤维细胞形态相似,胞体呈梭形或不规则三角形,中央有圆核,胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。 由于培养基内有pH指示剂的存在,因此它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色，细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时,则可能是培养时间过长,营养不足,死