人类ES-iPS培养手册.pdf

上海斯丹赛生物技术有限公司 www.SiDanS 人类 ES/iPS 细胞培养手册 1. 绪论1 2. 饲养层细胞的准备1 3. ES/iPS 细胞的复苏 3 4. ES/iPS 细胞的传代 3 5. ES/iPS 细胞的冻存 5 1. 绪论 本操作手册将为您详细介绍人胚胎干细胞/iPS 细胞培养的基础知识、技术细节及 相关的产品信息。目的是为了让您更好地培养您购买的细胞，请按照此手册进行 培养操作直至获得可靠的冻存细胞。上海斯丹赛生物技术有限公司专业提供各类 胚胎干细胞/iPS 细胞及成套产品服务，为您的干细胞研究提供一站式解决方案。 2. 饲养层细胞的准备 材料和仪器 ♦ CF-1 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF ），货号MEF-CF1-01 ♦ 成纤维细胞完全培养基，货号 EFM-01 ♦ 基质胶（Matrigel matrix ），BD Pharmingen ，货号 356235 ♦ CO2 培养箱，Thermo，HERA cell 240 ♦ Thermo-Fisher Finnpipette F3 移液器和灭过菌的枪头 ♦ T25 透气培养瓶，NUNC ，货号 156367 ♦ 2 ml 移液管，NUNC ，货号 159617 ♦ 5ml 移液管，NUNC ，货号 159625 ♦ 10 ml 移液管，NUNC ，货号 159633 ♦ 电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800 上海斯丹赛生物技术有限公司 www.SiDanS 2.1 加入足量的基质胶均匀铺到瓶（或孔板或皿）底部，以能覆盖全部底部为准， 譬如 T25 透气培养瓶以超过 0.5ml 为宜。 2.2 37 ℃培养箱放置至少 30min 。 2.3 从培养箱中取出瓶（或孔板或皿），轻轻推送板子将未被基质胶覆盖的地方再 次覆盖，然后立即吸弃基质胶。 2.4 加入适量成纤维细胞完全培养基（37℃预孵育超过 10min），譬如 T25 透气培 养瓶以加入 4ml 为宜。 2.5 从液氮中取出冻存的失活过的 MEF 细胞，立即投入 37℃水浴中，迅速解冻 （1min 之内）。 2.6 根据预实验将相应数量的饲养层细胞加到之前已经准备好的瓶（或孔板或皿） 2 中，混匀。推荐的饲养层细胞密度为3 万 cells/cm 。 Point 饲养层细胞需在 ES/iPS 细胞传代前两至三天准备。 饲养层细胞的密度最适宜是 80－90 ％, 太密或是太稀疏都容易使干细胞分化。 请在铺被前先做预实验估算细胞的复苏存活率，以一个 T25 培养瓶计算，若存活率为 90%，则铺入的细胞量应为 83.3 万。 ▲Note: 饲养层细胞铺了 10 天之后推荐不再使用。 Table1 培养容器的类型和需要的基质胶的体积 培养容器的类型 基质胶体积 24-well 0.1-0.2ml 12-well 0.2-0.4ml 6-well/35mm 0.4-0.5ml 60mm/T25 Flask 0.5-1ml 100mm/T75 Flask 2-3ml Table2 培养容器的面积和需要接种的 MEF 细胞悬浮液的体积（接种细胞的浓度为 1.5×105 cells/ml ） 培养容器的类型 细胞悬浮液的体积 24-well 0.4ml 12-well 0.8ml 6-well/35mm 2ml 60mm/T