原核表达及检测.doc

原核表达及检测 摘 要SDS凝胶电泳 广义的原核表达，是指发生在原核生物内的基因表达。狭义的原核表达，常出现于生物工程中。是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。 一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株。如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。 绿色荧光蛋白 ( green fl uorescent protei n, GFP)是 238个氨基酸组成的单体蛋白, 其分子量为27kDa 。1974年由Morie等从海洋生物水母中分离出来[ 1], 并且 Prasher等在 1992年从水母 Aequoreavictoria中成功克隆出了 GFP的 cDNA[ 2 ]。GFP作为一种新的报告基因,与以往 lacZ、 CAT等报告基因相比, 有很多无可比拟的优越性: GFP不具有种属依赖性, 在多种原核和真核生物细胞中都表达;荧光强度高, 稳定性高; 不需要反应底物与其他辅助因子,受蓝光激发产生绿色荧光, 尤其适用于体内的即时检测; 另外 GFP分子量小,易于融合, 适用于多种转化方式,对受体无毒害,安全可靠; 并且通过替换一些特殊氨基酸,可以使之产生不同颜色的光,从而适应不同的研究需要。 μl，接种于5ml的LB培养基中，加入50μlAmp（mg/ml），过夜活化菌株。 按照1:50的比例，从活化菌种中，取1ml的菌液接种于50mlLB培养基中，加入50μlAmp（mg/ml），扩大培养3h。 扩大后的菌液，取出10ml，不加IPTG,作为空白对照，剩余40ml菌液中加入40μlIPTG（0.5mol/l）,诱导蛋白表达。两者在37℃,200rpm的条件下培养3h。 用50ml的离心管收集菌体，8000rpm离心，离心3min，注意配平。 倒掉上清，加入40ml左右的dH2O洗菌液体一遍，12000rpm离心2min。注意将菌体充分打散。 倒掉上清，用枪头将上清吸干净，根据菌体的浓度，加入适量的PBS buffer 悬浮菌体。 用大功率的超声波将菌液破碎，期间超声波每工作2min，停止1min。菌体始终保持在冰水混合物上，以保证低温，蛋白质不易变性。如此反复6-10遍，直至菌液清澈。 12000rpm，离心3min，分离上清和沉淀。 在沉淀中加入250μl 1×SDS Loading buffer，取200μl 上清，加入50μl 5×SDS Loading buffer，在恒温加热器上100℃加热10min。 加样后的样品冷却到室温后，12000rpm，离心2min。 取上清40μl点样，按照一下的方法进行SDS检测。 11.制胶 a.根据目的片段的大小，制作不同浓度的分离胶（我们的蛋白分子量大约27kDa） 蛋白分子量（kDa） 凝胶浓度（%） 4-40 20 12-45 15 10-70 12 15-100 10 25-200 8 分离胶配方 15% 12% 8% ddH2O 3.4 ml 4.9 ml 6.9 ml 30%Acr-Bis(29∶1) 7.5 ml 6.0 ml 4.0 ml 1.5M Tris-Hcl(Ph8.8) 3.8 ml 3.8ml 3.8 ml 10%SDS 150 ml 150 ml 150 ml 10%过硫酸铵 150 ml 150 ml 150 ml TEMED 20 ml 20 ml 20 ml 总体积 15 ml 15 ml 15 ml 按表中所列顺序从上到下加试剂，加完TEMED后，轻轻摇匀液体，一块胶加7ml溶液。加完后，用1ml H2O封住分离胶液面，在室温（37℃）凝胶30min，至分离胶与水之间出现一条明亮的分界线，倾倒水层，用滤纸条将残余的水吸干。 b.制作浓缩胶 浓缩胶配方 5% ddH2O 3.4μl 30%Acr-Bis(29∶1) 0.85μl 1.5M Tris-Hcl(Ph8.8) 0.63μl 10%SDS 50μl 10%过硫酸铵 50μl TEMED 20μl 总体积 5ml 胶配好后混匀，灌胶2ml，插梳子时根据点样量和浓缩胶长短调整梳子插入的深度，于室温凝胶30min。 12.胶凝好后，拔梳子，将胶放入电泳槽中，加入1×Tris-Gly电泳缓冲液没过点孔，胶外侧缓冲液界面应完全没过电极。 13.Marker点5μl，用10μl小枪点样，以防样品冲出点样孔与旁边样品混杂。电压70V，保证电流在20mA-30 mA之间，当样品跑入浓缩胶时适当调高电压，但不宜多次调整