包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性.PDFVIP

中国试剂网 3.10.2.4 包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性 蛋白的复性是一个世界性的难题，没有通用的方法，甚至没有靠得住的规律，只 能试。 可以参考以下文章。该文出处已经忘了，如果有人知道原创作者或网上出处，请 补充。 包涵体表达的蛋白的复性包涵体表达的蛋白的复性 包涵体： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。 包涵体的组成与特性： 一般含有 50% 以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA 聚合酶、外膜蛋白 ompC、ompF 和ompA 等，环状或缺口的质粒DNA ，以及脂体、脂多糖等，大 小为0.5-1um，难溶与水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不 适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成 包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不 能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2 、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸 的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内 pH 接近蛋白的等电点时容易形成 包涵体。 4 、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类， 致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方 中国试剂网 3.10.2.4 法以增加可溶蛋白的比例。 包涵体表达的有利因素： 1、可溶性蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对 外源蛋白的降解。 2 、降低了胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。 3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分 离，有利于分离纯化。 4 、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。 破菌： 1、机械破碎 2 、超声破碎 3、化学方法破碎 分离： 1、离心：5000-20000g15min 离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。 2 、过滤或萃取方法： 洗涤： 由于脂体及部分破碎的细胞膜及膜蛋白与包涵体粘连在一起，在溶解包涵体之前 要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如2M 尿素在 50mM TrispH7.0-8.5 左 右,1mMEDTA 中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100 洗涤去除膜碎片和膜 蛋白。 溶解： 常用的变性剂有尿素（8M ）、盐酸胍（GdnHCl6-8M ），通过离子间的相互作用， 破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。其中尿素的增溶效果少差，异氰硫酸胍 （GdnSCN ）最强。 中国试剂网 3.10.2.4 去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以破坏蛋白内的疏水键，可以增溶几乎所 有的蛋白。问题是由于SDS 无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用。 极端pH ：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋白。如有人在pH9.0 溶解牛生长激 素和牛凝乳蛋白酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl 中。这些方法只适合 于少部分蛋白的增溶。 变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性性的环境中如 pH8.0-9.0 ，尿素在 碱性环境中不稳定，一般不要超过pH1.0 。有些蛋白只能用盐酸胍如IL-4 。增溶 时一般室温过夜，但盐酸胍在37 度1 小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。 还原剂： 由于蛋白间二硫键的存在，在增溶时一般使用还原剂。还原剂的使用浓度一般是 50-100mM2-BME 或DTT ，也有文献使用5mM 浓度。在较粗放的条件下，可以 使用5ml/l 的浓度。还原剂的使用浓度与蛋白二硫键的数目无关，而有些没有二 硫键的蛋白加不加还原剂无影响，如牛生长激素包涵体的增溶。对于目标蛋白没 有二硫键某些包涵体的增溶，有时还原剂的使用也是必要的，可能由于含二硫键 的杂蛋白影响了包