线性探针技术操作.pptxVIP

结核分枝杆菌线性探针耐多药检测方法 操作 试剂准备 核酸DNA提取 多重PCR扩增 杂交检测 2 Hain LPA 检测流程 3 4) 结果判读 利福平和异烟肼 3) 杂交 扩增产物和 固化在 膜上的特异性探针杂交 DNA提取 2) PCR扩增 试剂准备 区域：试剂准备区 设备：移液器（10ul, 20ul, 200ul,1000ul），振荡器，离心机 耗材：1.5ml离心管、管架，PCR管、管架， Tip头，废液缸 试剂：PNM试剂，热启动Taq酶试剂盒，分子生物级H2O 4 试剂准备 扩增体系配制（50ul） 5 试剂准备 分装（45ul/样本） 6 如果 不能立即实验，-20度保存。 核酸DNA提取 区域：模板制备区 设备：生物安全柜、水浴锅、超声破碎仪、离心机、移液器（1000ul，200ul，10ul） 耗材：一次性吸管，50ml离心管、管架，1.5ml离心管、管架，Tip头，计时器，记号笔，接种环，废液缸 试剂：消化前处理液（4%NaOH，2.94%柠檬酸钠，NALC），无菌PBS，无菌蒸馏水 7 核酸DNA提取-痰 6%NaOH和2.94%枸橼酸钠等体积混合，配制1%NALC前处理液。 取2ml涂阳痰标本转移到50ml离心管，加1-2倍体积前处理液，振荡30s,静置15分钟。 加PBS到45ml，3000g离心20min。 倒掉上清，加2ml PBS混匀沉淀，分别取1ml转移到1.5ml离心管。 取1支管12000rpm离心5min，吸弃上清。 8 核酸DNA提取-痰 每管加150ul无菌蒸馏水。 95度水浴/金属浴20Min。 超声裂解15min。 12000rpm离心5min。 上清转移到1.5ml离心管。 如不能立即实验，标本-20度保存。 9 核酸DNA提取-菌株 每个培养阳性菌株取1平环菌株放入含300ul无菌蒸馏水的1.5ml离心管。 85度灭活20min（生物安全柜内）。 95度水浴15min。 超声破碎20min。 12000rpm离心10min，上清转移到另一1.5ml离心管，用于扩增。 如果不能立即实验，-20度保存。 10 PCR扩增 每个病例取5ul DNA样本到扩增混合液中 11 PCR扩增 痰标本和菌株用不同程序 12 培养标本 直接病人标本 15 min 95℃ 1 个循环 1 个循环 30 sec95℃ 10 个循环 10 个循环 2min58℃ 25 sec 95℃ 40 sec 53℃ 20 个循环 30 个循环 40 sec 70℃ 8 min 70℃ 4℃ 24 h 1 个循环 1 个循环 扩增产物如果 不能及时杂交检测，短期4度保存。 杂交检测 区域：杂交区 设备：杂交仪，水浴锅，移液器（1000ul, 200ul, 20ul) 耗材： Tip头，废液缸，镊子，15ml离心管 试剂：Genotype 试剂盒，蒸馏水 13 杂交检测 化学变性 14 杂交检测 杂交（HYB和STR提前45度预热） 15 杂交检测 洗涤 16 杂交检测 耦合 17 杂交检测 洗涤3次 18 杂交检测 加底物显色液 19 杂交检测 洗涤 20 杂交检测 21 结果判读 CC：杂交对照 AC：扩增对照 TUB:鉴定结核分枝杆菌复合群 3个区域: rpoB, , katG 和inhA 27 条带：5个对照条带 22 结果判读 结核分枝杆菌复合群 TUB显色；未显色判为未检测到MTB 敏感 所有野生探针都显色且所有突变探针都未显色 耐药 任一野生探针未显色或任一突变探针显色 23 结果判读 24 25 操作图谱 26