生物化学技术原理.pptVIP

* SWAU 二、操作步骤 1、样品制备 2、IEF电泳(包括等电聚焦凝胶柱的制备，预电泳，加样和电泳，剥胶，固定) 3、平衡 4、SDS－PAGE（配胶，制备凝胶板，电泳，剥胶和显色） 5、染色和保存。 * SWAU 第八节、毛细管电泳 一、原理：毛细血管的一端为正极，另一端为负极，毛细管壁的材质是玻璃的，硅酸是主要成分，它可发生如下电离：H2SiO3=HSiO3--+H+。结果使管壁带有一定的负电荷。由于静电感应，管中缓冲液中的正离子和偶极分子水的正极趋向管壁，从而形成一个双电层。双电层中的正离子及定向排列的水分子在电场力和毛细张力的共同作用下，向负极移动，形成电渗流，其方向与电场方向一致。不同组分受到的作用力有差别的，正离子受到相同方向的电场力和电渗流的推动，前进速率较快；负离子受到两种力的作用但方向相反，电渗流的作用大于电场力，所以负离子也是向负极运动但运动速率最慢；不带电荷的组分虽然不受电场力的作用，但强大的电渗流推动着它从正极向负极运动。 * SWAU 所以毛细血管中的样品中各组分，不管是否带有电荷，也不管带何种电荷，都会从正极向负极移动，迁移速率按从大到小排列顺序是：正离子最大，负离子最小，中性分子居中。经过一定时间的电泳，各种组分会实现有效的分离。如果把单位电场强度下离子在一定的温度下在介质中迁移的速率称作淌度的话，那么毛细血管电泳实质上是高压电场为驱动力，以毛细管为分离管道，依据样品中以各种组分之间淌度和分配行为上的差别而实现分离的一类液相分离技术，兼有电泳和高效液相色谱两类分离技术原理。毛细管电泳和一般的电泳的区别是可以分离各种成分，同时在普通电泳中起破坏作用的电渗流在毛细血管电泳中却变成了有效的驱动力之一。毛细血管电泳与高效液相色谱的区别在于用高压电源取代了高压泵，改善了流动相在毛细管中的流型，用塞式流型代替了分析柱中的抛物线流型，使得各种组分分峰宽变窄，提高了分辨率 * SWAU 毛细管电泳仪 * SWAU 二、分类 1、毛细管区带电泳 CEZ是在毛细管内进行的自由溶液区带电泳;它采用均一的、组成不因电场作用而发生变化的电解质通信、通常是缓冲液作为背景电解质(BGE)，其作用是为电流的通过提供介质，建立稳定的电场，并影响样品组分的有效淌度。当被分离组分从毛细管一端引入后，各族分在电场力和电渗流的双重作用下以恒定但不同的速度向另一端迁移，经过一定时间以后，被分离成若干谱带。分离主要依赖于组分之间的有效淌度的差异。CZE可以实现阴阳离子同时分离，但对中型组分无分离效果。对CZE中的毛细管和BEG进行修饰可以衍生出许多其他的CE分离模式。 * SWAU 2、毛细管等电聚焦 CIEF是使毛细管内形成PH梯度，样品组分因其等电电的不同而分离。通常使用等电点有一定分布的同系的混合两性电解质溶液作为BGE,在外家电厂的作用下，BGE的组成沿毛细管轴向发生变化各两性电解按其等电大小依次排列性成稳定的pH梯度。当两性样品（如蛋白质）被引入后，在电场作用下，各组分均向等于其等电点值的PH处移动，到达此点后因失去净电荷而停止移动从而实现分离。可以用改变电解质体系或压力驱动的方式，进行洗脱。 * SWAU 3、毛细管等速电泳 毛细管等速电泳是一种不连续介质电泳技术。两极浸入不同的电解质溶液中，前导电解质中含有淌度大于样品中所有离子浓度的前导离子，尾随电解质中则含有淌度小于样品中所有离子淌度的尾随离子，样品加在两电解质的界面处，电泳达稳态后，各区带依次相随，界面清晰，以前导离子领先，尾随离子殿后，分析物按淌度大小的顺序排列向一端移动。 * SWAU 4、毛细管移界电泳 移界电泳是最早在分离中得到应用的一种技术，但由于它不能实现组分的完全分离，逐渐地被其他电泳方式所代替。使用毛细管后，其分离效率比较常规称界电泳大为提高，但并不能使该技术竞争过其它模式。 * SWAU 5、毛细管凝胶电泳 电泳是在凝胶填充的毛细管内进行，样品中各组分不仅受电场力的作用，耐用，而且还受凝胶的尺寸排阻效应（分子筛效应）的影响，因此提高了分离度，对荷/质比接近但分离分子大小形状不同的样品如蛋白质、RNA、DNA及其碎片具有很高的分离能力。常用的凝胶材料有交联或非交联凝胶两类。 * SWAU 第九节、琼脂糖凝胶电泳 对于分子量大的样品，如大分子核酸，病毒等，一般采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。 琼脂糖是经过挑选、质地较纯的琼脂作原料制成的。琼脂在化学上是由琼脂糖和琼脂胶组成的复合物。琼脂胶是一种含有硫酸根和羧基的多糖。它具有离子交换性质，这种性质给电泳和凝胶过滤以不良影响。琼脂糖是一直链多糖，它由D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖的残基交